[發明專利]擴增PKD1外顯子超長片段的PCR引物、檢測PKD1基因突變的試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201710274094.5
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN106995851B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 梅世月;孔祥東;白楠;胡爽
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 張清芳

本發明涉及傳病基因檢測領域，具體涉及擴增PKD1外顯子超長片段的PCR引物、檢測PKD1基因突變的試劑盒及應用。所述PKD1外顯子為第2至第46外顯子，該PCR引物為具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示堿基序列的引物。本發明試劑盒診斷準確率高，操作流程簡便高效。

技術領域

本發明涉及遺傳病基因檢測領域，更具體地，涉及一種擴增PKD1外顯子超長片段的PCR引物、檢測PKD1基因突變的試劑盒，以及所述PCR引物和試劑盒作為成人型多囊腎病致病基因檢測試劑的應用。

背景技術

多囊腎病(polycystic kidney disease，PKD)是一種雙側腎臟實質發生多個囊樣腫塊的遺傳性腎臟疾病。根據發病年齡和遺傳的特點，可以分為兩種類型：常染色體隱性遺傳型(嬰兒型)多囊腎；常染色體顯性遺傳型(成年型)多囊腎。成人型多囊腎較為常見，人群中的發病率為1/400-1/1000；成人型多囊腎為常染色體顯性遺傳病，其特點是具有家族聚集性，男女均可發病，大部分患者在30-50歲才出現典型癥狀，故稱“成人型”。成人型多囊腎的病理特征是雙側腎臟腫大，皮質、髓質出現多個大小不一的囊泡，且進行性增大，引起腎臟結構和功能損害。成人型多囊腎起病隱匿，患者早期臨床癥狀輕，甚至無癥狀，多數在無意發現腹部有包塊，或者體檢中發現。隨著年齡增長囊腫逐漸增大后，腎實質減少腎功能出現損害，臨床癥狀明顯。本病常累及腎外多個器官，患者常伴有多囊肝、高血壓、多囊脾臟、多囊胰腺、顱內動脈瘤等。約50％的患者在60 歲時進入終末期腎功能衰竭。目前尚無任何有效方法可以阻止多囊腎病的發展，成人型多囊腎家系成員非常關注尚無癥狀的幼年兄弟姐妹或子女的將來患病的風險，及患病人員生育下一代的問題。目前多囊腎病的診斷主要依據是雙腎的超聲、CT等影像學檢查。基因層面的確診對明確多囊腎病類型、早期干預及產前診斷預防該病發生起著更為關鍵的作用。

成人型多囊腎主要是由PKD1和PKD2基因突變致病，其中約85-90％的患者為 PKD1基因突變導致的，約10-15％為PKD2基因突變，PKD1是成人型多囊腎的主要致病基因。PKD1基因編碼的蛋白為多囊蛋白1(PC1)，是11次跨膜大分子蛋白，主要表達在腎小管上皮細胞的細胞膜表面，負責將細胞外環境信號傳遞給胞內信號分子。PKD1 基因位于染色體16p13.3區，基因體長達52kb，共有46個外顯子，編碼區長達12906bp。研究統計表明，成人型多囊腎基因缺陷以點突變致病為主，并且沒有明顯的突變熱點或者熱區，整個基因外顯子區及內含子剪切位點附近均可能發生突變而致病。PKD1基因存在6個高度同源的假基因，與PKD1基因1-33外顯子序列同源性高達97.7％，普通的 PCR難以避免假基因的干擾。另外，PKD1基因結構復雜，部分區域GC含量超過70％，增加了PCR和Sanger測序的難度。以上PKD1的基因結構特點和突變特點，給PKD1 基因檢測帶來的巨大的困難，突變檢出率較低。

根據PKD1基因的結構特點和突變類型，在新技術不斷革新的背景下，PKD1基因突變的檢測方法也在不斷地創新與優化，先后提出的檢測方法有：LR-PCR，變性高效液相色譜(DHPLC)、多重連接探針擴增(MLPA)、LR-PCR-高通量測序(NGS)、外顯子捕獲-高通量測序(NGS)。

傳統的巢式PCR-Sanger測序，先用若干個長片段PCR分別擴增PKD1基因的各個區域，然后針對每一個外顯子單獨PCR擴增，再測序。雖然PCR結合Sanger測序被認為是檢測基因突變的經典方法，但是對于由46個外顯子構成、編碼區長達12906bp的 PKD1基因而言，傳統的巢式PCR-Sanger測序技術耗費大量人力，成本高昂，效率低下。

巢式PCR-DHPLC方法，根據雙鏈DNA解鏈特征的差異，可以對PKD1基因巢式 PCR產物進行初步篩查，快速篩查有無突變。該方法的局限性是只能提供有無突變，不能得出具體的突變類型，不能直接檢測純合突變，并且結果判讀容易出錯。MLPA方法主要用于對PKD1基因大片段的缺失、重復或者重排，此類變異只占到PKD1異常患者的1-3％。