[發(fā)明專利]以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法

在審

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• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN107163139A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設計）人: 吳暉;武文佳;賴富饒;張猛猛;閔甜;李曉鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/16;C07K1/14
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 何淑珍

技術領域

本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工及其副產(chǎn)品綜合利用的技術領域，涉及以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法。

背景技術

小麥胚芽是小麥生長發(fā)育的重要器官，是小麥的生命源泉，被譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”。由于小麥胚芽中富含不飽和脂肪酸，色素和酶，會影響面粉的色澤及貯藏期，因此在制粉過程中往往將小麥胚芽剔除。我國每年可開發(fā)利用的小麥胚芽量高達幾百萬噸,但絕大多數(shù)都未被合理利用。目前對于小麥胚芽油的利用率較高，而剩余的脫脂小麥胚芽粕往往作為飼料或者直接丟棄，造成極大的浪費。因此如何利用脫脂小麥胚芽粕，以創(chuàng)造更大的經(jīng)濟效益具有十分重要的意義。

脫脂小麥胚芽中蛋白含量約為30%，其中球蛋白占的比例約為15.6%。球蛋白的氨基酸含量均衡，必需氨基酸占總氨基酸的比例在麥胚各蛋白中最高，其中蘇氨酸、纈氨酸、組氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量較高。除蛋氨酸外，其它必需氨基酸與FAO/WHO推薦模式相符。其次球蛋白的蛋白消化率在麥胚各蛋白中最高，是非常有價值的天然蛋白質(zhì)。經(jīng)過免疫活性評價發(fā)現(xiàn)，球蛋白具有一定的免疫效果。目前對于免疫蛋白主要是乳源及大豆源，小麥胚芽蛋白未見報道。多肽是蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，多肽與蛋白質(zhì)相比，更容易被機體所利用。目前已報道的免疫活性肽已有很多，但是主要是動物源活性肽。眾所周知，植物源活性肽相對動物源，更加安全、健康，來源廣泛，因此植物源的免疫活性肽越來越受到關注。植物源中大豆免疫活性肽報道的較多，而小麥胚芽源免疫活性肽尚未被報道。因此以小麥胚芽為原料，開發(fā)免疫活性蛋白和多肽對增加小麥的附加值也具有深遠意義。

蛋白及多肽的免疫活性評價方法包括非特異性免疫和特異性免疫，其中非特異性免疫指細胞的固有免疫，而特異性免疫又分為細胞免疫和體液免疫。本發(fā)明建立的免疫評價體系涵蓋了非特異性和特異性免疫，其中巨噬細胞吞噬中性紅屬于細胞的非特異性免疫，刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化屬于細胞免疫，而刺激巨噬細胞分泌的細胞因子，如一氧化氮、白介素、腫瘤壞死因子等具有殺傷侵入的外來物的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法，，使用本發(fā)明的方法可以獲得蛋白含量為85.3%，分子量主要分布在37kDa和55kDa，必需氨基酸與總氨基酸的比值（E/T）為42.49%，蛋白質(zhì)消化率校正后的氨基酸分數(shù)（PDCAAS）為0.42的免疫球蛋白以及水解度為9.1%-20.1%，分子量低于1450Da，蛋白含量為72.2%-84.6%，可溶性肽得率為40.3%-69.3%的免疫活性肽。

本發(fā)明技術方案如下。

以脫脂小麥胚芽為原料制備免疫球蛋白和免疫活性肽的方法，取脫脂小麥胚芽為原料，經(jīng)過鹽提酸沉，透析及冷凍干燥得到免疫球蛋白；用蛋白酶對球蛋白進行水解、大孔樹脂吸附與解離，濃縮及冷凍干燥，獲得水解度為9.1%-20.1%，分子量低于1450Da，蛋白含量為72.2%-84.6%，可溶性肽得率為40.3%-69.3%的球蛋白免疫活性肽。

上述方法，包括如下步驟：

（1）小麥胚芽球蛋白的制備：將過100-300目的脫脂小麥胚芽粉以1：10-1:30w/v的比例加入水，在20-40℃下攪拌1-3h，6000-9000r/min低溫離心10-20min后，將沉淀繼續(xù)以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mM Tris-HCl（pH 8.0）所述Tris-HCl中含0.3-0.5M NaCl的溶液，同樣在20-40℃下攪拌1-3h，6000-9000r/min低溫離心10-20min；獲得的上清液用0.1-1M的HCl調(diào)pH至4.0，6000-9000r/min低溫離心10-15min后，復溶并調(diào)pH至7.0，然后透析并冷凍干燥，得到麥胚球蛋白；

（2）酶解：將上述所得麥胚球蛋白配成4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保溫5-10min，再冷卻至37-55℃，用0.1-1M NaOH調(diào)節(jié)pH,使pH值在7.5-8.0，加入胰蛋白酶、堿性蛋白酶或中性蛋白酶，在37-55℃水浴下水解3h，反應過程中不斷加入1M的NaOH，使pH保持不變，水解完成后，調(diào)節(jié)pH至7.0，95-100℃滅酶5-10min，冷卻后，6000-9000r/min離心5-10min，保留上清液并冷凍干燥，得到多肽；

（3）大孔樹脂吸附與解離：將上述得到的多肽配成濃度為10-30g/L的溶液，吸附到大孔樹脂后，用水洗脫至流出液的吸光值與水接近，再用75%的乙醇洗脫，收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，得到免疫活性肽。