[發明專利]制備甘露糖偶聯近紅外量子點的方法

在審

• 申請號: 201710272162.4
• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN107325808A
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 孫明昊;韋超;馬東
• 申請（專利權）人: 上海雙洳生物科技有限公司
• 主分類號: C09K11/02
• 分類號: C09K11/02;C09K11/88;B82Y20/00;B82Y30/00
• 代理公司: 上海森華專利代理事務所(特殊普通合伙)31318
• 代理人: 姚維

技術領域

本發明涉及細胞示蹤技術領域，尤其涉及一種制備甘露糖偶聯近紅外量子點的方法。

背景技術

免疫細胞示蹤標記在生物醫學研究中非常有意義，甘露糖受體蛋白廣泛表達于多種免疫細胞，甘露糖偶聯的量子點是一種非常好的免疫細胞熒光標記材料。

作為一種用于生物熒光標記的納米粒子，量子點的光學穩定性大大優于有機熒光染料或熒光蛋白，在連續光激發下可以保持穩定的發光亮度和高量子效率。量子點具有寬的吸收光譜及窄的熒光發射光譜，可以通過改變其尺寸或組成調節其發光光譜。單波長可以同時激發具有不同發光譜帶的量子點，使得多路復用技術(multiplexing)成為可能。其生物穩定性、生物相容性及其與生物體系的相互作用可以通過改變表面性質來調節。這些特點使得量子點納米粒子在生物熒光標記的應用上具有有機熒光分子或熒光蛋白無法實現的優點。有望在將來成為新一代的生物熒光標記材料并用于包括細胞標記及示蹤、蛋白質印跡(western blot)、流式細胞計、酶聯免疫吸附、基因芯片、分子成像等生物應用。

目前全世界在制備量子點的方式上常見的有：

1.通過有機金屬合成。但含鎘的量子點具有較大的毒性，且使用該種方式合成得到的量子點具有疏水性，需要與水溶性分子的相互作用轉化為親水的納米粒子才能用于生物應用。

2.糖修飾的量子點。其通常采用的方法是，功能化的糖分子通過螯合作用包覆于量子點表面，或生物素(biotin)偶聯的糖分子與鏈霉親和素(streptavdin)偶聯的量子點結合，或通過疏水相互作用的功能化。但這些方法得到的產物或者穩定性差，或者步驟復雜，重復性差，不宜工業化。

因此，針對以上缺陷，需要對現有技術進行改進。

發明內容

針對以上缺陷，本發明提供一種制備甘露糖偶聯近紅外量子點的方法。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

第一步，制備酰亞胺功能化甘露糖。

首先，將2-溴代甘露糖乙酯及硫脲溶于無水丙酮，氬氣保護下加熱至丙酮回流，反應20分鐘；冷卻反應物至室溫得到白色結晶；過濾反應液收集晶體，得到產物2-硫代異脲基甘露糖乙酯溴化氫。

其次，將2-硫代異脲基甘露糖乙酯溴化氫，氯乙氰溶于丙酮和水的混合溶液；在反應液中加入碳酸鉀及亞硫酸鈉，室溫下反應30分鐘后加入冰水，攪拌2小時；收集沉淀水洗；粗產物硅膠柱層析分離提純，得到產物2-硫代乙氰基甘露糖乙酯。

最后，將 2-硫代乙氰基甘露糖乙酯溶于無水甲醇，向反應液中加入甲醇鈉溶液，氬氣保護下室溫反應20小時，得到酰亞胺功能化甘露糖。

第二步，制備胺基功能化近紅外量子點。

首先，制備疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點：

將氯化亞銅、氯化銦、硒脲、十八烯及三辛基膦的混合物超聲30分鐘，加入油胺及十二烷基硫醇，反應液經過無水無氧操作后加熱至50-60攝氏度，攪拌10小時后得到無色透明的反應液；

將反應液冷卻至室溫后加熱至200攝氏度，可見反應溶液的顏色從無色逐漸變為黃色，紅色最終為黑褐色，反應溫度至200度后立即終止反應并降溫；

向反應混合物中加入甲醇/丙酮混合溶劑，沉降的納米粒子經過高速離心分離后溶于無水氯仿中，用0.22微米的尼龍濾頭過濾；

銅銦硒量子點的氯仿溶液與十八烯、油胺置于反應瓶中，真空條件下除去氯仿，得到疏水的氨基近紅外銅銦硒/硫化鋅量子點。

其次，制備二乙基黃原酸鋅反應液：

將二乙基黃原酸鋅與油酸鋅溶于十八烯、三辛基膦及二辛基胺的混合溶液得到鋅溶液并分成兩部分，先將一部分的鋅溶液加入銅銦硒量子點溶液中加熱至190度，反應后再將另一部分剩余的鋅溶液加入反應溶液中繼續反應；

將反應混合物冷卻至室溫，加入丙酮/甲醇（1/3體積比）沉降納米粒子。離心分離后的納米粒子溶于氯仿中并過濾，得到的溶液用于配體交換。

再次，合成多齒胺基聚合物配體：

使聚丙烯酸與CDI在有機溶劑存在下反應，加入BOC保護的氨基PEG，再加入N,N-二甲基乙二胺和硫辛胺的氯仿溶液進一步反應，得到的產物用飽和氯化鈉水溶液洗三次后收集有機相，分離提純得到聚合物配體前體物，使所得聚合物配體前體物與1，3-丙環酰內酯反應，和分離提純得到多齒胺基聚合物配體。