[發明專利]用于純化硫酸軟骨素酶ABC的方法

有效

• 申請號: 201710271643.3
• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN107177578B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 黃炳镠;鐘瑋康
• 申請（專利權）人: 愛華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 閻娬斌;劉丹丹

本發明公開了用于純化硫酸軟骨素酶ABC的方法。該方法包括使用固定有肝素的親和柱，通過層析法從所述含有硫酸軟骨素酶ABC的基質中獲得純化的所述硫酸軟骨素酶ABC。該方法能夠獲得高純度的硫酸軟骨素酶ABC，并且具有簡單和高回收率的優點。

技術領域

本發明涉及用于純化硫酸軟骨素酶ABC(ChABC)的方法，尤其涉及從含有ChABC的基質純化ChABC的方法。

背景技術

硫酸軟骨素是生物系統中最豐富的糖胺聚糖，由包括硫酸化葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、艾杜糖醛酸等的多種硫酸化和非硫酸化碳水化合物衍生物組成。該聚合物通常與蛋白質連接，形成硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)，在生物系統中發揮許多結構和功能作用(例如，使細胞-細胞相互作用的細胞外基質、指導或抑制神經發育、合成軟骨以及成為結構成分)。這些分子的生物合成并保持合適的位置對于人的正常功能是至關重要的。事實上，許多疾病與CSPG的缺乏、積累和脫位有關，如彌漫性路易體病、粘多糖病Ⅳ-A型和粘多糖病Ⅶ型、椎間盤突出癥等。

硫酸軟骨素酶是可以有效降解硫酸軟骨素的細菌酶。這組酶可以分為具有不同活性和底物特異性的4種類型(硫酸軟骨素酶ABC，軟骨素酶AC，硫酸軟骨素酶B和硫酸軟骨素酶C)。最近已證明這些酶，特別是硫酸軟骨素酶ABC是用于治療許多CSPG相關疾病的潛在的新生物藥物，例如，McMachon和同事已經發現ChABC可以顯著促進受損的脊髓的功能恢復。Kubota和Naitoh也證明將硫酸軟骨素酶注射到瘢痕疙瘩和/或肥厚性瘢痕患者的受影響部分可以大大改善癥狀。Takahashi還開發了使用ChABC治療兔子椎間盤突出癥的成功模型。近年的科學研究指出，ChABC還有更多有待開發的醫學應用，包括治療弱視、神經和脊髓損傷，后玻璃體脫離和抑制腫瘤轉移。

ChABC能否成功作為生物治療劑應用，明顯取決于生產和純化高純度ChABC的工藝。ChABC的現有上游生產技術均是基于未修飾的普通變形桿菌(Proteus Vulgaris)或重組表達宿主(如大腸桿菌)的發酵。通過適當優化，這兩種表達方法都可以產生大量未經純化含有ChABC的菌液或粗酶液。因為菌液或粗酶液含有大量蛋白質、核酸及內毒素等雜質，開發高效的下游純化方法對于獲得高純度ChABC至為關鍵。此外，來自不同表達宿主的雜質的份量和性質非常不同，所以為了純化來自特定表達宿主的ChABC將需要單獨制定的特定的下游純化程序，特別是當只使用非特異性相互作用的離子交換(IEX)或疏水相互作用(HIC)層析時更是如此。事實上，IEX/HIC層析法的開發和優化非常耗時，需要投入大量人力物力，而通常的結果是需要多個IEX/HIC層析步驟以獲得高純度的目標蛋白，代價是大幅降低回收率及長時間的純化流程。

相對于IEX/HIC層析法，在蛋白質純化中應用親和層析法具有顯著的優點，例如相對快速的優化過程，簡單的層析過程，高洗脫液純度，高回收率等。在親和層析法中，與靶蛋白的特異性相互作用的分子或分子部分固定在填料上。這種高度選擇性相互作用能有效地提取需要的蛋白及去除雜質。此外，利用親和層析作為ChABC的純化工具從未被探索過，因此開發新的且有效的親和層析方法對于生產作為生物治療藥物的ChABC將具有莫大貢獻。

然而，設計ChABC的親和層析是不容易的。這是因為可以特異性結合ChABC的大多數已知分子是ChABC的底物，其在與酶結合時將被降解。換句話說，如果這些底物分子固定在固定相上，那么它們在純化過程中將被酶分解，從而不能從溶液中捕獲ChABC。硫酸軟骨素酶ABC具有比硫酸軟骨素酶AC、硫酸軟骨素酶B和硫酸軟骨素酶C具有更廣的底物譜。這使得設計ChABC的親和層析相比于硫酸軟骨素酶AC、硫酸軟骨素酶B和硫酸軟骨素酶C更加困難。