[發明專利]用于純化硫酸軟骨素酶ABC的方法

有效

• 申請號: 201710271643.3
• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN107177578B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 黃炳镠;鐘瑋康
• 申請（專利權）人: 愛華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司 37101
• 代理人: 閻娬斌;劉丹丹

1.一種從含有硫酸軟骨素酶ABC 的基質純化硫酸軟骨素酶ABC 的方法，其包括使用固定有肝素的親和柱，通過層析法從所述含有硫酸軟骨素酶ABC 的基質中獲得純化的所述硫酸軟骨素酶ABC，其中所述方法包括：

將所述含有硫酸軟骨素酶 ABC 的基質的 pH 值調節至 7.0，并將導電率調節到 1-5mS/cm 范圍內，對所述含有硫酸軟骨素酶 ABC 的基質進行0.22μm過濾，并將所述含有硫酸軟骨素酶 ABC 的基質加載到經pH 7.5的25 mM Tris-乙酸鹽預平衡緩沖液預平衡的所述固定有肝素的親和柱上；

用洗滌液洗滌加載后的親和柱以去除非特異性結合的蛋白質;以及

用洗脫液洗脫所述硫酸軟骨素酶 ABC;

其中，所述洗滌如下之一進行：

用（1）pH7.5的100mM Tris-乙酸鹽、（2）pH8的60mM Tris-乙酸鹽和（3）pH9.2的100mMTris-乙酸鹽洗滌；

用（1）pH7.5的25mM Tris-乙酸鹽、（2）pH8的60mM Tris乙酸鹽和（3）pH9的100mM Tris乙酸鹽洗滌；或者

用（1）pH 7.0的25mM Tris-乙酸鹽、（2）pH 8.0的60mM Tris-乙酸鹽和（3）pH 10的100mM Tris-乙酸鹽洗滌；

所述洗脫液為 pH 6-9的0-0.5M NaCl 線性梯度溶液；并且

純化后硫酸軟骨素酶 ABC 的內毒素水平低于 0.0002 EU/U，并且其中所述硫酸軟骨素酶ABC由SEQ ID NO：1編碼。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述方法還包括在所述洗脫步驟之后通過過濾去除含有所述硫酸軟骨素酶 ABC 的洗脫液中的內毒素的步驟。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述基質包括細菌的細胞勻漿和/或在細菌發酵過程中收集的上清液。

4.根據權利要求3 所述的方法，其特征在于，其中所述基質包括來自大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、和普通變形桿菌(Proteus vulgaris)的一種或多種的勻漿。

5.根據權利要求 1或2所述的方法，其特征在于，其中所述肝素固定在具有羥基、氨基和/或羧基的用于蛋白質純化的樹脂上。

6.根據權利要求5 所述的方法，其特征在于，其中所述樹脂包括瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、二氧化硅聚丙烯酰胺和丙烯酸聚合物的一種或多種。

7.根據權利要求5 所述的方法，其特征在于，其中所述肝素利用共價鍵結合到所述樹脂上。

8.根據權利要求 1、2或7 所述的方法，其特征在于，其中所述固定有肝素的親和柱不進一步使用糖胺聚糖包被。