[發明專利]質粒組合物、DNAPK基因敲除大鼠模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201710265724.2
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN108728487B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 沈月雷;白陽;張美玲;周小飛;姚佳維;蘇幼紅;余巧玲;杜吉超;趙會珍
• 申請（專利權）人: 北京百奧賽圖基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京悅成知識產權代理事務所(普通合伙) 11527
• 代理人: 高艷麗;樊耀峰

本發明公開了一種質粒組合物、DNAPK基因敲除大鼠模型的構建方法及應用。通過構建特定的能夠特異性地識別大鼠DNAPK基因上的兩段相鄰核苷酸序列的一對轉錄激活子樣效應因子，并利用這對轉錄激活子樣效應因子獲得一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶，對大鼠DNAPK基因進行準確、高效的打靶，進而獲得DNAPK基因敲除大鼠模型。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地涉及一種質粒組合物、DNAPK基因敲除大鼠模型的構建方法及應用。

背景技術

全世界范圍內針對人類不同疾病進行治病機理研究和藥物開發從未停止，但由于受到人類自身倫理和技術實現的限制，很多研究不能在人類自體上直接進行，而需要在與人類相近的動物體上進行實驗。大鼠作為嚙齒類模式動物，已經成為人疾病相關基礎研究和藥物開發不可或缺的動物模型。近年來，通過基因工程技術改造大鼠特定基因從而得到特定基因型和表型的模式大鼠已經成為研究熱點，其中免疫缺陷大鼠模型的建立對人類疾病研究和藥物開發具有重大意義。

DNAPK基因編碼的蛋白被稱為DNA依賴蛋白激酶的催化亞基，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在非同源重組的DNA修復(NHEJ)中起重要作用。在免疫細胞的V(D)J重排中起重要作用。已有研究發現，在DNAPK基因缺失的小鼠和人體內，可導致細胞內非同源重組能力的缺失，成熟B細胞和T細胞的比例嚴重降低，從而使得免疫能力嚴重缺失，因此又被稱為重度聯合免疫缺陷癥(Severe Combined Immunodeficiency，SCID)。缺失了DNAPK基因功能的小鼠被稱為SCID小鼠，已被廣泛用于異體移植、免疫疾病研究和人源化小鼠的制備中。由于胚胎干細胞提取和培養方法在大鼠上還不成熟，長期以來利用傳統方法制備大鼠基因敲除模型比較困難。與小鼠相比，大鼠生理結構更接近人類，其體形大，能夠提供足夠血樣且易于進行手術操作，可以彌補小鼠模型的不足，而且有關大鼠免疫系統疾病的研究和模型開發仍處于起步階段，因此本領域有必要制備DNAPK缺失大鼠模型。

現有研究表明，具有F344背景的基因敲除大鼠的免疫缺陷程度更嚴重，且表現一些不同的表型，包括體型較小、繁殖功能低下、生長遲緩、早衰且無免疫“滲漏”現象。已知F344大鼠因自身血清胰島素含量低、腦垂體大、易自發生成腫瘤，被廣泛用于癌癥發生的研究，局限性較大。有鑒于此，有必要制備其他背景的基因敲除大鼠模型。

發明內容

為了解決至少部分上述技術問題，本發明通過構建特定的能夠特異性地識別大鼠DNAPK基因上的兩段相鄰核苷酸序列的一對轉錄激活子樣效應因子，并利用這對轉錄激活子樣效應因子獲得一對轉錄激活子樣效應因子核酸酶，對大鼠DNAPK基因進行準確、高效的打靶，進而獲得DNAPK基因敲除大鼠模型。至少基于上述部分內容完成了本發明。具體地，本發明包括以下內容。

本發明提供一種用于引起細胞內基因組結構改變的質粒組合物，所述質粒組合物包含第一質粒和第二質粒，所述第一質粒用于產生第一多肽，所述第二質粒用于產生第二多肽；

其中所述第一多肽能夠特異性識別并結合SEQ ID NO:2所示的序列或其互補序列，所述第二多肽能夠特異性識別并結合SEQ ID NO:3所示的序列或其互補序列；和

所述SEQ ID NO:2所示的序列和所述SEQ ID NO:3所示的序列各自為源自大鼠DNAPK基因第4外顯子的序列。

根據本發明的質粒組合物，優選地，所述大鼠DNAPK基因第4外顯子具有SEQ IDNO:1所示的序列。

根據本發明的質粒組合物，優選地，所述第一質粒的堿基序列如SEQ ID NO:5所示，和/或第二質粒的堿基序列如SEQ ID NO:6所示。

本發明還提供一種引起細胞內基因組結構改變的方法，所述方法包括使用上述質粒組合物的步驟。