[發明專利]分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法

有效

• 申請號: 201710264739.7
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107036987B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 姜翠翠;葉新福;方智振;周丹蓉;潘少霖
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院果樹研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：對照CK的測定，樣品提取液制備，脫鹽，酶促反應，GPI活性計算；

所述酶促反應的酶為6-磷酸葡萄糖脫氫酶，己糖激酶以及蔗糖轉化酶；

具體步驟為：

（1）對照CK的測定：蔗糖轉化酶將蔗糖轉化為葡萄糖和果糖，葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下脫氫引起吸光值變化Abs1=（A1_CK-A0_CK）；

（2）樣品提取液的制備：取0.15g冷凍的李果肉樣品，用1.6ml提取液研磨至勻漿；

（3）脫鹽：提取完成后4℃，12000g下離心20min，取上清液過G25脫鹽柱，收集脫鹽產物；

（4）酶促反應：取脫鹽產物100ul于800ul反應體系測定，該反應體系含100mM pH為6.9的咪唑-HCl，5mM MgCl₂，0.5mM NAD，1mM ATP，100ul提取液，2U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，2U己糖激酶，2U蔗糖轉化酶，以加入10mM的蔗糖起始反應，于340nm處檢測吸光值的變化Abs2=（A1-A0）；

（5）GPI活性計算：利用公式GPI= n·(Abs2-Abs1)/(6.22·w·t)計算GPI活性，其活性單位為nmol·g^-1·s^-1；其中，n為稀釋倍數，6.22為吸光系數w為樣品質量， t為反應時間。

2.根據權利要求1所述的一種分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法，其特征在于，所述步驟（2）或（4）中的提取液成分為50mM pH為7.5的Hepes–KOH緩沖液，2mM EDTA，10mM MgCl₂，10mM 二硫蘇糖醇，1%(w/v) 曲拉通X-100，30% (w/v) 甘油，1% (w/v) 牛血清蛋白，5% (w/v) 聚乙烯吡咯烷酮，和1mM 苯甲磺酰氟。