[發(fā)明專利]分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710264739.7
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107036987B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發(fā)明（設計）人: 姜翠翠;葉新福;方智振;周丹蓉;潘少霖
• 申請（專利權）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發(fā)明具體涉及一種分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶（glucose?6?phosphate isomerase,GPI）活性的方法。本發(fā)明方法主要包括以下步驟：對照CK的測定，樣品提取液制備，脫鹽，酶促反應，GPI活性計算。本發(fā)明方法簡便、快速、準確，具有良好的重復性，可作為李果實中GPI活性的測定方法。

技術領域

本發(fā)明屬于分析化學技術領域，具體涉及一種分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法。

背景技術

葡萄糖-6-磷酸異構酶( Glucose-6-phosphate isomerase，GPI; EC 5. 3. 1.9)是一類具有多功能生物活性的天然蛋白質(zhì)，它參與糖代謝的磷酸戊糖途徑和糖酵解作用，催化葡萄糖-6-磷酸 ( glucose-6-phosphate，G-6-P) 和果糖-6-磷酸( fructose-6-phosphate，F(xiàn)-6-P) 的相互轉化，從而催化F-6-P異構化為G-6-P。

李屬薔薇科李亞科李屬植物，全世界廣泛栽培，其中中國李是栽培種中最大的一個種。李酸甜適度，風味極佳。研究表明李果實發(fā)育的早期，果糖和葡萄糖含量較低，而蔗糖含量相對較高；果糖和蔗糖隨著果實的發(fā)育成熟呈逐漸下降的趨勢。隨著果實的發(fā)育，葡萄糖增加顯著，成為主要的可溶性糖。經(jīng)測定，李果實中GPI 活性與葡萄糖含量顯著正相關，與果糖含量呈顯著負相關。因此能準確有效地測定出果實中GPI的活性變化，是探討糖轉化、積累的關鍵指標。

目前關于GPI活性的研究主要集中在人和動物上，植物上研究較少。本實驗采用分光光度計法測定李果實中GPI活性，建立的方法準確可靠，簡便快捷，是一種測定李果實GPI活性的有效途徑，可為李成熟果實果糖轉化為葡萄糖提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法，該方法準確可靠，簡便快捷，是一種測定李果實GPI活性的有效途徑。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種分光光度計測定李果實中磷酸葡萄糖異構酶活性的方法，包括以下步驟：對照CK的測定，樣品提取液制備，脫鹽，酶促反應，GPI活性計算。

其中，所述酶促反應的酶為6-磷酸葡萄糖脫氫酶，己糖激酶以及蔗糖轉化酶。

其具體步驟為：

（1）對照CK的測定：蔗糖轉化酶將蔗糖轉化為葡萄糖和果糖，葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下脫氫引起吸光值變化Abs1=（A1_CK-A0_CK）；

（2）樣品提取液的制備：取0.15g冷凍的李果肉樣品，用1.6ml提取液研磨至勻漿；

（3）脫鹽：提取完成后4℃，12000g下離心20min，取上清液過G25脫鹽柱，收集脫鹽產(chǎn)物；

（4）酶促反應：取脫鹽產(chǎn)物100ul于800ul反應體系測定，該反應體系含100mM pH為6.9的咪唑-HCl，5mM MgCl₂，0.5mM NAD，1mM ATP，100ul提取液，2U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，2U 己糖激酶，2U蔗糖轉化酶，以加入10mM的蔗糖起始反應，于340nm處檢測吸光值的變化Abs2=（A1-A0）；

（5）GPI活性計算：利用公式GPI= n·(Abs2-Abs1)/(6.22·w·t)計算GPI活性，其活性單位為nmol·g^-1·s^-1；其中，n為稀釋倍數(shù)，6.22為吸光系數(shù)w為樣品質(zhì)量， t為反應時間。