[發明專利]一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法

在審

• 申請號: 201710264321.6
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107126581A
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 張春松;吳長應
• 申請（專利權）人: 蕪湖揚展新材料科技服務有限公司
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/36;A61L27/38;A61L27/60;A61L27/58
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 范奇

技術領域

本發明屬于復合生物材料制備領域，具體涉及一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法。

背景技術

近年來，具有增殖和分化潛能的干細胞己經成為皮膚組織工程中好的種子細胞。胚胎干細胞在皮膚組織工程中應用研究，為構建組織工程皮膚在皮膚損傷修復的應用提供了理論依據。但是胚胎干細胞在醫學應用上存在道德倫理問題和致瘤性等限制因素，而具有多向分化潛能的多能干細胞一一間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)作為良好的種子細胞，在皮膚組織工程研究中倍受關注。以往的研究主要是集中于骨髓來源的BMSCs但BMSCs需要通過骨髓穿刺而獲得，且數量隨年齡增長而下降，這都限制了BMSCs的應用，且支架材料的選擇和應用一直影響該技術發展的重要難題。

發明內容

根據現有技術中存在問題，本發明采用新生兒娩后“廢棄物”的胎盤組織獲取CMSCs，并選用絲素蛋白作為支架材料，制得胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料。

本發明采用以下技術方案：

一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：機械剝除胎盤羊膜組織，將剝離后剩下的絨毛組織，過質量濃度75％的酒精，再用PBS沖洗洗盡血漬，并將其剪成1mm²小塊后，浸沒于含有質量濃度0.1％的IV型膠原酶的低糖基礎培養基(L-DMEM)中，37℃消化15-45分鐘,得細胞組織液；

步驟二：細胞組織液經200目篩網過篩后轉移至干凈的離心管，1200rpm離心lOmin，棄上清液后接種于含有質量濃度10％的胎牛血清的低糖基礎培養基(L-DMEM)中，于37℃、5％CO₂的培養箱中培養5天后進行第一次換液，隨后每隔兩天進行換液，待細胞融合至90％使用質量濃度0.25％的胰酶進行消化，得胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(CMSCs)；

步驟三：將2L去離子水燒熱至沸騰，加入4g碳酸鈉及5g家蠶生絲，煮沸30min后，用去離子水清洗干凈并烘干，再用9.3mol/L的LiBr溶液溶解蠶絲，溶解濃度20wt％，待完全溶解后將溶液裝入透析袋，去離子水透析72h，9000r/min離心20min，重復兩次，得絲素蛋白溶液；

步驟四：將絲素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然風干后獲得絲素蛋白膜；

步驟五：將絲素蛋白膜溶于質量濃度98％甲酸中，然后裝入注射器中進行靜電紡絲，紡絲針頭內徑0.9mm，調整紡絲電壓在10-15KV，距離在8-15cm，速度為0.1-O.5m/h，獲得絲素蛋白納米纖維膜；

步驟六：取生長狀況良好的胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(CMSCs)接種于絲素蛋白納米纖維膜上，接種時間為2-12h，即得胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料。

優選的，所述的步驟一還包括：將剝離后剩下的絨毛組織制成面積為10cm²。

優選的，步驟一中所述的PBS中含有質量濃度0.1％的青-鏈霉素。

優選的，所述的步驟五還包括：將絲素蛋白納米纖維膜冷凍干燥，并置于24孔板中，于放射CO⁶⁰輻射消毒。

優選的，所述的絲素蛋白溶液中添加有質量濃度20％的絲素蛋白納米纖維溶液。

優選的，所述的絲素蛋白納米纖維溶液采用以下方法制備：取絲素蛋白溶液置于60℃恒溫箱內濃縮至原體積的一半，再轉入通風櫥內濃縮至質量分數為20-30％的濃縮液，將濃縮液放入4℃冰箱儲存2d后將濃縮液加水稀釋到質量分數為0.5％，充分均勻攪拌后放入恒溫箱內孵育至形成半透明凝膠狀的絲素蛋白納米纖維溶液。

本發明的有益效果在于：

1)胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(CMSCs)具有較強的增殖、分化能力，且取材的便利，不涉及社會倫理等問題的優勢，其作為種子細胞在皮膚組織工程中具有極大的運用前景。

2)絲素蛋白生物相容性良好，降解速度緩慢、且降解產物對組織具有低免疫原性，對皮膚、牙周等組織有營養和修復能力，絲素蛋白作為支架材料，為細胞生長、代謝提供場所，為形成新組織提供適宜的環境，此外還能調控和誘導的分化，形成新的具有功能性的組織和器官。

3)本發明制得的敷料，可以加快皮膚修復，具有優良的組織修復的功效。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。

一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，包括以下步驟：