[發明專利]一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法

在審

• 申請號: 201710264321.6
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107126581A
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 張春松;吳長應
• 申請（專利權）人: 蕪湖揚展新材料科技服務有限公司
• 主分類號: A61L27/22
• 分類號: A61L27/22;A61L27/36;A61L27/38;A61L27/60;A61L27/58
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 范奇

1.一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：機械剝除胎盤羊膜組織，將剝離后剩下的絨毛組織，過質量濃度75％的酒精，再用PBS沖洗洗盡血漬，并將其剪成1mm²小塊后，浸沒于含有質量濃度0.1％的IV型膠原酶的低糖基礎培養基中，37℃消化15-45分鐘,得細胞組織液；

步驟二：細胞組織液經200目篩網過篩后轉移至干凈的離心管，1200rpm離心lOmin，棄上清液后接種于含有質量濃度10％的胎牛血清的低糖基礎培養基中，于37℃、5％CO₂的培養箱中培養5天后進行第一次換液，隨后每隔兩天進行換液，待細胞融合至90％使用質量濃度0.25％的胰酶進行消化，得胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(CMSCs)；

步驟三：將2L去離子水燒熱至沸騰，加入4g碳酸鈉及5g家蠶生絲，煮沸30min后，用去離子水清洗干凈并烘干，再用9.3mol/L的LiBr溶液溶解蠶絲，溶解濃度20wt％，待完全溶解后將溶液裝入透析袋，去離子水透析72h，9000r/min離心20min，重復兩次，得絲素蛋白溶液；

步驟四：將絲素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然風干后獲得絲素蛋白膜；

步驟五：將絲素蛋白膜溶于質量濃度98％甲酸中，然后裝入注射器中進行靜電紡絲，紡絲針頭內徑0.9mm，調整紡絲電壓在10-15KV，距離在8-15cm，速度為0.1-O.5m/h，獲得絲素蛋白納米纖維膜；

步驟六：取生長狀況良好的胎盤絨毛膜來源間充質干細胞(CMSCs)接種于絲素蛋白納米纖維膜上，接種時間為2-12h，即得胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料。

2.根據權利要求1所述的一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，其特征在于，所述的步驟一還包括：將剝離后剩下的絨毛組織制成面積為10cm²。

3.根據權利要求1所述的一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，其特征在于：步驟一中所述的PBS中含有質量濃度0.1％的青-鏈霉素。

4.根據權利要求1所述的一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，其特征在于，所述的步驟五還包括：將絲素蛋白納米纖維膜冷凍干燥，并置于24孔板中，于放射CO⁶⁰輻射消毒。

5.根據權利要求1所述的一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，其特征在于：所述的絲素蛋白溶液中添加有質量濃度20％的絲素蛋白納米纖維溶液。

6.根據權利要求5所述的一種胎盤干細胞復合蠶絲蛋白敷料的制備方法，其特征在于，所述的絲素蛋白納米纖維溶液采用以下方法制備：取絲素蛋白溶液置于60℃恒溫箱內濃縮至原體積的一半，再轉入通風櫥內濃縮至質量分數為20-30％的濃縮液，將濃縮液放入4℃冰箱儲存2d后將濃縮液加水稀釋到質量分數為0.5％，充分均勻攪拌后放入恒溫箱內孵育至形成半透明凝膠狀的絲素蛋白納米纖維溶液。