[發明專利]一種墨蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法

在審

• 申請號: 201710264047.2
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107094624A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 丁漢鳳;賈文斌;辛富剛;王存娥;顏廷進
• 申請（專利權）人: 山東省農作物種質資源中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 陳曉蕾

技術領域

本發明涉及一種墨蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法。屬于植物組織培養技術領域。

背景技術

墨蘭（學名：Cymbidium sinense （Jackson ex Andr.）Willd.）又名報歲蘭，是蘭科蘭屬地生植物。假鱗莖卵球形，包藏于葉基之內。葉帶形，近薄革質，暗綠色?；ㄝ銖募禀[莖基部發出，直立，較粗壯，一般略長于葉；花的色澤變化較大，較常為暗紫色或紫褐色而具淺色唇瓣，一般具有較濃的香氣。其繁殖方法一般為分株繁殖，3～4年才能進行一次，繁殖速度較慢。墨蘭種子非常細小、呈粉狀，沒有胚乳，只有一個簡單的胚，外面包著疏松、透明、不易透水的種皮，胚內含有很少的營養物質，絕大部分為脂類物質，自然條件下墨蘭種子很難萌發。因此，傳統的種子保存技術不適用墨蘭種質資源保存。

墨蘭多數栽培品種均是由野生種馴化或自然變異篩選而來。從資源上來說，由于對野生國蘭資源的大量采挖，天然資源已遭到了大量破壞，可采集的野生資源越來越少，再加上自身繁殖速度極其緩慢，我國野生墨蘭資源日趨緊缺，有些珍稀品種已瀕臨滅絕，因此，建立科學、有效、實用的墨蘭種質資源保存技術迫在敏捷。通過有計劃的培育、繁殖、發展、保存瀕危的特有種類，才能避免該物種滅絕。

組織培養作為植物種質資源離體保存技術已被廣泛使用，在種質資源交換過程中，利用試管苗進行交換不僅運輸成本低，還可避免在交換過程中病蟲害的傳播，也可以解決大田保存占地面積大、費用高等問題。頻繁的離體繼代培養保存技術，在每一次繼代培養過程中都有可能造成交叉污染，多次的繼代培養還會引發遺傳變異，同時，隨著繼代培養數量的增加要耗費大量的人力物力。

發明內容

本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種墨蘭種質資源離體保存方法。

本發明還提供了所述離體保存方法保存后恢復生長的方法。

為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：

一種墨蘭種質資源離體保存方法，從墨蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于VW培養基輔以0.5～1mg/L 6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導培養基表面培養成原球莖，將原球莖進行反復切割和繼代培養，所采用的繼代培養基為VW培養基輔以0.2～0.4mg/L 6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數量的原球莖，然后采用VW培養基輔以2.5mg/L多效唑（PP333）的離體保存培養基進行培養，待原球莖進入發育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養。

優選的，所述莖尖的剝取方法如下：選擇長度為5～7cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝去最外層的1～2個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3～4秒，放入質量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3～4次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝取大小約為0.5mm的莖尖。

優選的，將莖尖置于試管或培養瓶中原球莖誘導培養基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導培養基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標記。

優選的，原球莖的培養方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養15天后，出現明顯膨大，30天后出現若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。

優選的，反復切割和繼代培養的具體方法是：將生長為4～6mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養基中繼續擴增培養，建立無性繁殖系，反復切割和繼代培養，從而短時間繁殖出所需數量的原球莖。

優選的，所述發育生長階段是選擇發育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養7天。

優選的，暗培養階段應當定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養瓶。

優選的，暗培養階段所使用的離體保存培養基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養基的試管或培養瓶應當密閉良好，以減少離體保存培養基中水分的揮發。

進一步優選的，試管或培養瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外層纏繞3層塑料保鮮薄膜。

上述離體保存方法保存后恢復生長的方法，將暗培養中的原球莖轉移至分化培養基上，由原球莖分化產生幼苗；所述分化培養基為KC培養基輔以質量濃度10%的香蕉汁，培養溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。