[發明專利]一種墨蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法

在審

• 申請號: 201710264047.2
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107094624A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 丁漢鳳;賈文斌;辛富剛;王存娥;顏廷進
• 申請（專利權）人: 山東省農作物種質資源中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司11429
• 代理人: 陳曉蕾

1.一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，從墨蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于VW培養基輔以0.5～1mg/L 6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導培養基表面培養成原球莖，將原球莖進行反復切割和繼代培養，所采用的繼代培養基為VW培養基輔以0.2～0.4mg/L 6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數量的原球莖，然后采用VW培養基輔以2.5mg/L多效唑的離體保存培養基進行培養，待原球莖進入發育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養。

2.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，所述莖尖的剝取方法如下：選擇長度為5～7cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝去最外層的1～2個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3～4秒，放入質量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3～4次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝取大小約為0.5mm的莖尖。

3.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，將莖尖置于試管或培養瓶中原球莖誘導培養基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導培養基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標記。

4.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，原球莖的培養方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養15天后，出現明顯膨大，30天后出現若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。

5.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，反復切割和繼代培養的具體方法是：將生長為4～6mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養基中繼續擴增培養，建立無性繁殖系，反復切割和繼代培養，從而短時間繁殖出所需數量的原球莖。

6.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，所述發育生長階段是選擇發育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養7天。

7.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，暗培養階段應當定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養瓶。

8.根據權利要求1所述的一種墨蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，暗培養階段所使用的離體保存培養基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養基的試管或培養瓶應當密閉良好，以減少離體保存培養基中水分的揮發。

9.權利要求1～8所述離體保存方法保存后恢復生長的方法，其特征在于，將暗培養中的原球莖轉移至分化培養基上，由原球莖分化產生幼苗；所述分化培養基為KC培養基輔以質量濃度10%的香蕉汁，培養溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。

10.根據權利要求9所述的保存后恢復生長的方法，其特征在于，原球莖在分化培養基上接種30天后，在原球莖頂端部分出現由葉原基發育成的幼葉，隨后幼葉迅速生長，待出現第2～3片葉時，原球莖向下伸長，并且有第1條根生出；50天后，等到幼苗有2～3條根，5～6片葉，生長到10cm左右，發育成完整的植株，將試管苗移栽在育苗基質中，在自然條件下生長成正常植株。