[發明專利]一種斑茅植物根尖分生區染色體標本的制備方法

在審

• 申請號: 201710263670.6
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN106896008A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 王勤南;吳嘉云;常海龍;凌秋平;張偉;邱永生;陳俊呂;謝靜
• 申請（專利權）人: 廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業研究所）
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 廣州市一新專利商標事務所有限公司44220
• 代理人: 唐弟,周佳

技術領域

本發明涉及植物細胞遺傳學中的植物染色體中期相標本的制備方法，尤其涉及斑茅植物根尖染色體的制備方法。

技術背景

染色體是遺傳物質的載體，在不同的物種中染色體具有較為穩定的數目和形態。細胞染色體遺傳研究在遺傳育種具有重要的地位，染色體標本的制備是細胞遺傳學研究的基本實驗方法。植物染色體標本制備包括以下幾個流程：根尖培養、取材、前處理、固定、酶解（或解離），制片及鏡檢。

斑茅Erianthus arundinaceus (Retz.) Jeswiet.為多年生草本，直立叢生，無地下莖，分布極廣，適應性極強。它具有抗旱、耐澇、耐瘠、抗病蟲能力強、分蘗多、宿根性好、生長力旺盛等特點，具有甘蔗育種者所追求的能被甘蔗育種所利用的優異性狀，所以倍受世界各國育種家青睞。目前國內外已經突破了甘蔗與斑茅的屬間雜交獲得了多代材料。斑茅及其與甘蔗雜交的后代對甘蔗遺傳改良具有重要的意義。

多數的斑茅的染色體數目2n = 60條，研究人員也曾發現有2n = 40條，但比水稻、玉米、高粱等作物染色體條數多，染色體制片難度大。特別是斑茅根尖的培養一直是個難點，傳統的植物根尖培養的方法如水稻、玉米、小麥是通過種子發芽等根尖來獲得。斑茅為無性系植物一般參照甘蔗的方法，通過獲取斑茅植物的莖段，對莖段的節上根點保濕培養來獲得新生的根，長至1cm左右取根尖。但是斑茅莖多為空綿心，節上的根點較少，保濕后能長出根的根點更少，傳統方法培養根需要大量的斑茅莖段，此外在培養莖段過程中的溫度和濕度控制的要求較高，根尖長出后容易褐化停止生長，以致要獲得活性較強的根尖不容易。以傳統的斑茅制片方法獲得較好的染色體制片難度大，研究人員都在尋求一種高效的斑茅染色體制備方法，能在較短時間內獲得活性好的斑茅根尖，具有較多的分裂相細胞，不需要反復砍莖培養、取根，節省人力物力，提高斑茅染色體制備效率。

發明內容

本發明的目的是提供一種斑茅植物根尖分生區染色體標本的制備方法，其具有節省時間和實驗材料及勞力，提高實驗效率的效果。

本發明的技術方案如下：

一種斑茅植物根尖分生區染色體標本的制備方法，包括以下步驟。

（1）根尖培養：

初春，剪取斑茅幼嫩植株種植于培養桶內，培養桶的側邊及底部打孔透水，桶內底部為保水透氣基質，通過正常的水、肥及除草等栽培管理，3~4個月后斑茅的根會盤繞于桶內的四周及底部。

（2）根尖取樣及前處理：

于夏季晴朗天氣早晨8:00~10:00，將整植株連同基質與培養桶分離，挑選活性高的根尖，用手術刀切取約0.5cm的根尖，放置于蒸餾水中漂洗，漂洗后投入濃度為0.002M的8-羥基喹啉水溶液25~28℃處理3~4小時，處理后用蒸餾水漂洗，紗布擦去根系表分泌物后，再放置于卡諾氏固定液中、4℃冰箱處理24~48小時。

（3）根尖酶解

從步驟（2）的冰箱中取出根尖，用蒸餾水漂洗2~3次，洗凈固定液后，放置于0.075M KCl溶液前低滲1小時，后取出根尖放置于含有纖維素和果膠酶的酶解混合溶液中酶解5~8小時，酶解后用蒸餾水洗去酶解液，后低滲1小時，轉入卡諾氏固定液固定0.5小時。

（4）染色體制片

用手術刀和鑷子將步驟（3）的根尖分生區細胞解離出，并均勻涂抹于玻片上，晾干。

（5）鏡檢

將步驟（4）中晾干的玻片置于具有相差功能的光學顯微鏡下進行鏡檢，選擇染色體形態好、分散好的細胞，做好記錄，-80℃保存備用。

優化方案是：步驟（3）所述的酶解混合液的濃度，纖維素和果膠酶的質量濃度分別為3.5%和1.75%。

本發明與現有技術相比具有以下突出的實質性特點和顯著的進步。

1. 本發明采用的是桶栽整株取根的方法進行根尖培養，根尖活性強，效果穩定，具有節省時間、實驗材料及勞力、提高實驗效率等優點。

2. 本發明獲得的細胞制片干凈，細胞中期分裂相多，染色體分散、形態好，可用于染色體進行核型分析或下游實驗（如染色體熒光原位雜交）等染色體遺傳研究，為斑茅種質染色體遺傳研究提供有效的技術儲備。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的說明。

實施例

一種斑茅植物根尖分生區染色體的制備方法，包括如下步驟。