[發明專利]一種流行性乙型腦炎的重組酶常溫擴增核酸（RT?RPA）試紙條檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201710260637.8
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107164558A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 陳金頂;張靜遠;梁輝;鄧少鋒;朱夢嬌;趙明秋;丁紅星
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種檢測流行性乙型腦炎病毒的等溫擴增技術與封閉式側向流層析技術相結合的試劑盒及應用。

背景技術

流行性乙型腦炎又稱日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)，簡稱乙腦，是由流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一種中樞神經系統的急性人畜共患傳染病，被世界動物衛生組織(OIE)列為二類動物疫病，被我國衛生部列為乙類傳染病。該傳染病主要以三帶緣庫蚊 (Culex tritaeniorhynchus)作為主要的傳播媒介，以高熱和狂暴或者沉郁等神經癥狀為主要特征。流行性乙型腦炎的爆發具有明顯的季節性和一定的地理分布區，多發生于夏秋季節蚊類孳生的季節，屬于自然疫源性蟲媒傳染病。

乙型腦炎主要流行于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，特別是亞洲東部、東南部的水稻產區，氣候溫暖、潮濕多雨，蚊蟲大量孳生時最為流行，故該病大規模流行呈現一定的周期性。乙型腦炎流行初期主要發生在日本、朝鮮和中國等溫帶地區，日本于1924年首次證實該病，并分離到病毒。如今，乙型腦炎已經擴展到北起俄羅斯、西伯利亞，南至澳大利亞，東抵美國關島，西達印度西海岸，而其流行區域還在逐漸擴大。我國處于乙腦病毒流行區域，是乙腦發病人數最多的國家，先后爆發過三次乙腦流行，除了青海、新疆、西藏以外的各省市均有發病的報道。乙型腦炎的流行呈明顯的季節性，發病的高峰期在7、8月之間。隨著乙腦疫苗的推廣和規范，乙腦的發病率明顯下降，局部區域時有爆發，疫區主要分布在河南、安徽、江蘇、江西等地，尤其是海南、廣東、臺灣以及福建。

流行性乙型腦炎病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，乙型腦炎病毒粒子為球形，二十面體對稱，直徑約35-40nm，分子量為4.2×106D。JEV基因組全長約11kb，由5′-UTR(Untranslated Region,UTR)、3′-UTR以及僅有的一個開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)共同組成一個開放式閱讀框(ORF)，編碼大小為3432個多聚蛋白體。其中，E蛋白是JEV最重要的結構蛋白，也是目前研究最廣泛和充分的蛋白。E蛋白分子量為53kDa，含有500個氨基酸殘基，其對應的基因組也是相對保守的區域。

目前常用于檢測流行性乙型腦炎的方法包括病原的分離鑒定、血清學方法和RT-PCR、熒光定量PCR。其中病原的分離鑒定是最傳統的檢測方法，其結果準確可靠，但其影響因素多，實際操作起來相當費時費力，因此在臨床應用中有一定的局限性；血凝抑制試驗、補體結合試驗、中和試驗和酶聯免疫吸附試驗等血清學試驗的敏感性及特異性較低，操作也比較麻煩；而RT-PCR、熒光定量PCR技術需要特殊的儀器設備(如PCR儀和凝膠成像系統等)和專業人員進行相關的操作，顯然無法滿足基層和現場檢測的需求。

重組酶聚合酶等溫擴增技術(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA) 是由重組酶聚合酶介導的擴增原理，模擬生物體內DNA復制，在常溫下即可對目標片段進行等溫擴增。該技術主要依賴于三種酶：T4噬菌體編碼的重組酶蛋白uvsX和uvsY、單鏈結合蛋白gp32及Bsu DNA聚合酶。其中，重組酶蛋白可以與引物結合，形成DNA核蛋白微絲，微絲可以結合匹配的DNA片段，并緊密結合發生重組，在單鏈結合蛋白的幫助下,模板DNA開始解鏈,在bsu DNA 聚合酶的作用下進行復制延伸,對模板上的目標區域進行指數式擴增。整個過程僅需在37-42℃下反應20-40分鐘即可。與PCR相比，整個過程不需要高溫變性和低溫退火，反應簡單、快速高效。目前，該技術已經成功應用于各種病原檢測以及轉基因、癌癥等多個領域。Ahmed Abd EI Wahed等應用RT-RPA設計了禽流感(H7N9)病毒的便攜式診斷方法，同時，也開發了埃博拉病毒的便攜式RT-PCR 裝置；Chien-Chung Chao等研發了立克次體的RPA檢測方法。但目前沒有將該技術應用到流行性乙型腦炎上。

本發明針對流行性乙型腦炎病毒的E基因，建立并評估了基于RT-RPA核酸試紙條檢測試劑盒。與常規PCR引物不同，RPA所需的引物長度為30-35bp，探針序列的長度為46-52bp,引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構，其長度的增加也使引物設計及選擇難度的增加，因此，引物的設計和選擇對RPA 的結果至關重要。RPA技術正處于起步研究階段，尚無專門的引物、探針設計軟件，也沒有大量的數據為其引物設計原則提供依據。

發明內容