[發(fā)明專利]一種流行性乙型腦炎的重組酶常溫擴增核酸（RT?RPA）試紙條檢測試劑盒及應用

在審

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• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107164558A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設計）人: 陳金頂;張靜遠;梁輝;鄧少鋒;朱夢嬌;趙明秋;丁紅星
• 申請（專利權）人: 華南農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所44329
• 代理人: 楊曉松

1.一種用于快速檢測流行性乙型腦炎的重組酶常溫擴增核酸(RT-RPA)試紙條試劑盒，其特征在于包含如下引物組和核酸檢測試紙條：

所述的引物組的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-(Biotin)CGGAAAACCATGGGAATTACTCAGCGCAA-3’

下游引物：5’-CATGTGCCTCTTCAAATTCCATGAGGAGTTC-3’

探針：5’-(Fitc(FAM))CTCCTTGGTTCACAATCCAGTGTGACTTCTC(THF)CATAATCACCAAGCT(C3spacer)-3’。

2.根據權利要求1所述的檢測流行性乙型腦炎病毒的RT-RPA核酸試紙條試劑盒，其特征在于：所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條。

3.根據權利要求2所述的檢測流行性乙型腦炎病毒的RT-RPA核酸試紙條試劑盒，其特征在于：還包含全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置；全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內得到。

4.根據權利要求1所述的檢測流行性乙型腦炎病毒的RT-RPA核酸試紙條試劑盒，其特征在于：還包含TwistAmpTM nfo kit包括重組酶聚合酶凍干酶粉、水解緩沖液Rehydration Buffer、280mM醋酸鎂溶液。

5.根據權利要求1～4任一項所述的檢測流行性乙型腦炎病毒的RT-RPA核酸試紙條試劑盒的應用，其特征在于包含以下步驟：

(1)在RPA凍干顆粒中加入29.5μL Rehydration Buffer,2.1μL 10μM Primer A,2.1μL 10μM Primer B,0.6μL 10μM探針,9.2μL雙蒸水,4μL模板,在反應管蓋上加280mM醋酸鎂2.5μL，上下顛倒反應管使之充分混勻后離心，恒溫反應；

(2)反應：將步驟(1)恒溫反應后的產物用核酸檢測試紙條檢測，2～5min觀察結果；

(3)結果判讀：直接肉眼判讀

①陰性：僅在質控區(qū)一條紅色條帶，在檢測區(qū)內無紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測的樣本沒有流行性乙型腦炎病毒感染；

②陽性：出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)內，另一條位于質控區(qū)內，證明所檢測的樣本為流行性乙型腦炎病毒感染；

③無效：質控區(qū)和檢測區(qū)內均無紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。

6.根據權利要求5所述的檢測流行性乙型腦炎的RT-RPA核酸試紙條試劑盒的應用，其特征在于：

步驟(1)中所述的上游引物的終濃度為420nM；

步驟(1)中所述的下游引物的終濃度為420nM；

步驟(1)中所述的探針的終濃度為120nM；

步驟(2)中所述的恒溫反應在金屬浴中進行，溫度設定為37-42℃，時間為15min-30min，結束后使用側流層析試紙條對結果進行檢測。

7.根據權利要求5所述的檢測流行性乙型腦炎病毒的RT-RPA核酸試紙條試劑盒的應用，其特征在于：

步驟(2)中所述的恒溫反應的條件為37℃反應20min。