[發明專利]一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法

有效

• 申請號: 201710258480.5
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN107266562B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 肖建喜;蔡向東;李婷婷;趙莎
• 申請（專利權）人: 武漢采思生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/107;G01N21/64;A61K49/00
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 李婷玉

本發明公開了一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法。其包括：膠原多肽探針的設計，設計特定氨基酸序列的膠原多肽，包括:①、中間含有較多的((Gly?Pro?Hyp)n或(Gly?Pro?Pro)n重復序列，以幫助多肽可以與膠原蛋白特異性結合；②、多肽序列的特定位置修飾發光物質；膠原多肽探針的制備，通過固相合成法，合成特定序列的膠原多肽，再使用發光物質修飾該膠原多肽；膠原纖維染色；體外成像。本發明設計的膠原多肽探針制備簡單，檢測方便，無生物毒性，能特異性的結合膠原蛋白，在腫瘤，關節炎等膠原蛋白相關疾病的早期檢測與療效評價等領域具有巨大的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

膠原蛋白作為哺乳動物體內最豐富的的蛋白，是細胞外基質的主要組成成分，在組織形成和維持體內平衡中起到關鍵作用。當膠原蛋白的產生和降解平衡遭到破壞時，會引起諸多疾病，其中一些疾病可能致命。在膠原重建過程中，若膠原產生過剩，過量的膠原在器官中累積，易產生組織纖維化，最終導致腫瘤等嚴重疾病；或者膠原不可控降解導致膠原蛋白退化性疾病，如關節炎。在諸多病理條件中，膠原蛋白分子的三重螺旋結構被蛋白酶在細胞外環境中酶解。因此，設計和制備能特異性識別膠原蛋白的探針對這些疾病的診斷和治療具有重要意義。目前，已研發出一些短肽和抗體用于膠原蛋白的識別及成像，但是，這些檢測方法存在價格昂貴，操作復雜，特異性差，結合能力弱等缺陷。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法。本方法是利用特定序列的膠原多肽可以特異性的結合部分解鏈的膠原蛋白，特異性好、結合能力強、制備簡單，檢測方便，無生物毒性。

本發明的一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法，其包括以下步驟：

(1)膠原多肽探針的設計

設計特定氨基酸序列的膠原多肽，包括:①、中間含有較多的(Gly-Pro-Hyp)n或(Gly-Pro-Pro)n重復序列，以幫助多肽可以與膠原蛋白特異性結合；②、多肽序列的特定位置修飾發光物質；

(2)膠原多肽探針的制備

通過固相合成法，合成特定序列的膠原多肽，再使用發光物質修飾該膠原多肽；

(3)膠原纖維染色

在膠原纖維分散液中加入膠原多肽探針溶液，4℃孵育3h，離心棄上清液，用1xPBS洗掉未結合探針；

(4)體外成像

在組織切片上加封閉液，放置10-50min后吸走液體，使用探針溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用DAPI稀釋液染色，使用1x PBS洗掉未結合探針和過量DAPI稀釋液，滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照；

(5)體內成像

將膠原多肽探針注射入實驗活體內，然后麻醉后放入成像裝置中進行成像試驗。

所述步驟(1)中膠原多肽探針的序列為X-(Gly-Pro-Hyp)n(n為4-20之間的整數)，X-(Gly-Pro-Pro)n(n為4-20之間的整數)，(Gly-Pro-Hyp)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)m(n和m為1-20之間的整數)，或(Gly-Pro-Pro)n-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)m(n和m為1-20之間的整數)中的一種；其中X為發光物質，Gly為甘氨酸，Pro為脯氨酸，Hyp為羥脯氨酸，Amp為4-氨基脯氨酸。