[發明專利]一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針及其制備和成像方法

有效

• 申請號: 201710258480.5
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN107266562B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 肖建喜;蔡向東;李婷婷;趙莎
• 申請（專利權）人: 武漢采思生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/107;G01N21/64;A61K49/00
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 李婷玉

1.一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針的制備和成像方法，所述方法為：

（1）膠原多肽探針的設計

設計特定氨基酸序列的膠原多肽，所述膠原多肽的序列為(Gly-Pro-Hyp)3-Gly-Pro-Amp(-FAM)-(Gly-Pro-Hyp)3，其中FAM為羧基熒光素，Gly為甘氨酸，Pro為脯氨酸，Hyp為羥脯氨酸，Amp為4-氨基脯氨酸；

（2）膠原多肽探針的制備

通過固相合成法，合成特定序列的膠原多肽，再將FAM修飾到所述膠原多肽的Amp側鏈上；

（3）膠原纖維染色

在膠原纖維分散液中加入膠原多肽探針溶液，4℃孵育3h，離心棄上清液，用1×PBS洗掉未結合探針；

（4）體外成像

在組織切片上加0.2-0.8mL封閉液，放置10-50min后吸走液體，使用80-120μL探針溶液染色，在2-6℃孵育1-3hrs，吸去染色液后，使用80-120μL DAPI稀釋液染色0.5-1.5min，使用1×PBS洗掉未結合探針和過量DAPI稀釋液，滴封固液，加蓋玻片，使用熒光顯微鏡觀察拍照；

（5）體內成像

將膠原多肽探針溶于已滅菌的含半胱氨酸的1×PBS中，將其注射入到實驗活體內，將活體動物麻醉后放入成像裝置中進行成像試驗。

2.根據權利要求1所述一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針的制備和成像方法，其特征在于，所述步驟（2）中多肽固相合成的具體方法為：

a) 將80-120mg的樹脂加入到具有篩板的反應器中，使用2-8mL二氯甲烷溶脹樹脂；

b) 由15-25%哌啶/N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液脫除N端Fmoc保護基，通過顯色反應來檢測保護基的脫除程度；

c) 將N端Fmoc保護的氨基酸4eq與HOBT 4eq和HBTU 4eq由DMF溶解，低溫活化10-30min，向溶液中滴加DIEA 6eq，溶液混合均勻后加入到反應器中，反應1-6hrs；

d) 反應結束后，反應液由反應器中抽出，樹脂分別由2-8mL DMF和DCM洗2-4次，顯色反應檢測氨基酸縮合完全，樹脂由15-25%哌啶/DMF溶液處理3次，分別為5min、5min和15min，樹脂分別由5mL DMF和DCM洗3次，顯色反應檢測保護基脫除完全；

e) 之后重復步驟c)和d)，直到合成目標序列的膠原多肽后，然后向反應器中加入20-30%乙酸酐，顯色反應檢測反應完全后，樹脂分別由3-8mL DMF和DCM洗2-4次；

f) 樹脂分別用DCM和甲醇輪流洗滌2-4次，然后將樹脂抽干，加入切割液，切割液的組分為TFA:TIS:水的質量比為90:5:5，反應1-6hrs；

g) 向反應液中加入冰乙醚，將多肽沉淀，然后通過離心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入過量冰乙醚再次沉淀并離心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗滌2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反應液相色譜純化得純肽；

h) 將20-30mg純肽由DMF溶解，稱取熒光物質4eq、HOBT 4eq和HBTU 4eq，由DMF溶解，低溫活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA 4-10eq，混合液加入到多肽溶液中，避光反應12-48hrs；

i) 將反應液加入冰乙醚中，得到黃色沉淀，黃色沉淀由水溶解并透析除去熒光物質，然后將溶液凍干得到探針。

3.根據權利要求1所述一種特異性識別膠原蛋白的膠原多肽探針的制備和成像方法，其特征在于，所述步驟（3）中膠原纖維由Ⅰ型膠原醋酸溶液在NaCl溶液中透析得到，將0.5-1.5mg/mLⅠ型膠原蛋白醋酸溶液在NaCl溶液中透析，得到膠原纖維；將0.05-0.15mg/mL探針溶液加入到膠原纖維分散液中，在4℃孵育3hrs，離心后棄上清液，然后加入1×PBS振蕩，離心后棄上清液，重復三次，用以洗掉未結合探針，然后將處理后的膠原纖維分散液滴于載玻片上，使用熒光顯微鏡獲取圖像。