[發明專利]骨髓間充質干細胞來源的外分泌體的應用及其試驗方法

在審

• 申請號: 201710257925.8
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN106906271A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 莊文卓
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙)32251
• 代理人: 陸金星

技術領域

本發明涉及生命科學領域，具體涉及一種骨髓瘤病人骨髓間充質干細胞來源的外分泌體在提高骨髓瘤細胞藥物敏感性中的應用，還涉及一種驗證該種應用效果的試驗方法。

背景技術

外分泌體（exosome）是由多種細胞分泌到細胞外的小囊泡，具有抗原呈遞和誘導抗腫瘤免疫作用。長期以來，細胞來源的外分泌體被認為是無意義的細胞殘核，但近年來的研究發現，它是促進細胞間信息交流的重要機制，能穩定存在于人體血液等多種體液中。

外分泌體最早是由Johnstone等人在研究網織紅細胞向成熟紅細胞轉變過程中發現的。它是一種直徑約30~100nm，密度介于1.13~1.21g/cm3、雙凹圓盤狀、外包雙層脂質膜的囊泡。蛋白質占據了外分泌體的絕大部分內容物，包括參與其結構形成的蛋白質，如微管蛋白、肌動蛋白等細胞骨架成分，多分布于外分泌體的表面或內腔中；還有膜轉運和融合相關蛋白，如Flotillin1、TSG101等以及四跨膜蛋白CD9、CD81。來源于外分泌體的miRNA在干細胞分化的調控、胚胎發育和器官發生、造血和腫瘤發生等生理和病理過程中起重要調節作用。

間充質干細胞來源的外分泌體包含MSC特異性的mRNA，如神經性的RAX2、成骨性的BMPl5、上皮性的CEACAM5以及造血性的EPX等。不同來源的外分泌體有其特異的蛋白和不同的行使功能的關鍵分子。例如源于網織紅細胞的外泌體富含轉鐵蛋白受體，源于抗原提呈細胞的外泌體含有主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ類分子及其共刺激分子，腫瘤細胞自身分泌的外泌體表面富含主要組織相容性復合體分子、伴侶分子熱休克蛋白和腫瘤相關抗原。

發明內容

本發明目的是提供一種骨髓瘤病人骨髓間充質干細胞來源的外分泌體的新應用，以提高骨髓瘤病人骨髓瘤細胞的藥物敏感性，同時本發明還提供了一種測試髓瘤病人骨髓間充質干細胞來源的外分泌體對骨髓瘤細胞藥物敏感性的試驗方法。

本發明的技術方案是：一種骨髓間充質干細胞來源的外分泌體的應用，具體應用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤細胞的藥物敏感性。

一種骨髓瘤病人骨髓間充質干細胞來源的外分泌體對骨髓瘤細胞藥物敏感性影響的試驗方法，包括以下步驟：

1）外分泌體的提取

一種可快速從細胞外液中提取外分泌體的方法，提取出的外分泌體量較大，可以保證無菌，且可以用于后續的生物活性實驗。具體的步驟如下：

1.1）血清去除外分泌體：血清用超速離心機在4℃條件下，100000xg離心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm濾膜過濾除菌，即可得到無菌的無外分泌體的血清，抽濾完成后于4℃保存備用；

1.2）細胞用含有10%無外分泌體血清的培養基培養，培養24~72h后可用于提取細胞分泌到細胞外液中的外分泌體；

1.3）16%PEG儲存液的制備：稱取5.944g氯化鈉和16g PEG8000，溶解于100ml去離子水中，磁力攪拌器攪拌溶解完成后用0.22μm濾膜過濾除菌，即可得到無菌的16%PEG儲存液，4℃保存備用；

1.4）取步驟1.2）中由含10%無外分泌體血清的培養基培養的細胞懸液于15ml離心管中，1000rpm離心5min，去除細胞；

1.5）然后轉移步驟1.4）中15ml離心管內的上清于一支15ml離心管中，3000rpm~4000rpm離心30min，去除細胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接著吸取步驟1.5）中15ml離心管內的上清于另一支15ml離心管中，加入等體積的16%PEG儲存液，使得PEG的工作濃度達到8%，4℃過夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，將步驟1.6）中得到的細胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm條件下離心60min，離心完成后去上清，所得沉淀即為從細胞外液中所提取到的外分泌體。

2）外分泌體的定量

2.1）取步驟1.6）中得到的細胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm條件下離心60min，離心完成后去上清，所得沉淀即為從細胞外液中所提取到的外分泌體；

2.2）向步驟2.1）中提取到的外分泌體中加入100ul 1×細胞裂解液，超聲波破碎儀破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法測定濃度，即可知道1ml細胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌體的量；

2.3）根據比例，取不同體積同批次的細胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm條件下離心60min，即可得到不同量的外分泌體，用于后續的細胞活性實驗。

3）外分泌體活性實驗