[發(fā)明專利]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外分泌體的應(yīng)用及其試驗方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710257925.8
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN106906271A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莊文卓
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙)32251
• 代理人: 陸金星

1.一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外分泌體的應(yīng)用，其特征在于：該種外分泌體用于提高骨髓瘤病人的骨髓瘤細(xì)胞的藥物敏感性。

2.一種用于驗證如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用的試驗方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）外分泌體的提取

1.1）血清去除外分泌體：血清用超速離心機在4℃條件下，100000xg離心2h，去除沉淀，然后取上清用0.22μm濾膜過濾除菌，即可得到無菌的無外分泌體的血清，抽濾完成后于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2）細(xì)胞用含有10%無外分泌體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24~72h后可用于提取細(xì)胞分泌到細(xì)胞外液中的外分泌體；

1.3）16%PEG儲存液的制備：稱取5.944g氯化鈉和16g PEG8000，溶解于100ml去離子水中，磁力攪拌器攪拌溶解完成后用0.22μm濾膜過濾除菌，即可得到無菌的16%PEG儲存液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.4）取步驟1.2）中由含10%無外分泌體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞懸液于15ml離心管中，1000rpm離心5min，去除細(xì)胞；

1.5）然后轉(zhuǎn)移步驟1.4）中15ml離心管內(nèi)的上清于一支15ml離心管中，3000rpm~4000rpm離心30min，去除細(xì)胞碎屑及大的囊泡；

1.6）接著吸取步驟1.5）中15ml離心管內(nèi)的上清于另一支15ml離心管中，加入等體積的16%PEG儲存液，使得PEG的工作濃度達(dá)到8%，4℃過夜孵育，使其聚集沉降；

1.7）次日，將步驟1.6）中得到的細(xì)胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm條件下離心60min，離心完成后去上清，所得沉淀即為從細(xì)胞外液中所提取到的外分泌體；

2）外分泌體的定量

2.1）取步驟1.6）中得到的細(xì)胞上清和PEG混合液1ml，于3000rpm~4000rpm條件下離心60min，離心完成后去上清，所得沉淀即為從細(xì)胞外液中所提取到的外分泌體；

2.2）向步驟2.1）中提取到的外分泌體中加入100ul 1×細(xì)胞裂解液，超聲波破碎儀破碎五次，使其充分裂解，然后用BCA蛋白定量法測定濃度，即可知道1ml細(xì)胞上清和PEG混合液中可提取的外分泌體的量；

2.3）根據(jù)比例，取不同體積同批次的細(xì)胞上清和PEG混合液于3000rpm~4000rpm條件下離心60min，即可得到不同量的外分泌體，用于后續(xù)的細(xì)胞活性實驗；

3）外分泌體活性實驗

3.1）按照步驟2）的方法提取出不同量的外分泌體；

3.2）鋪板5×105骨髓瘤細(xì)胞于96孔細(xì)胞板中，加入不同量的外分泌體；

3.3）培養(yǎng)一段時間后，于每孔中加入對骨髓瘤半致死濃度的咔菲佐米，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)3~4天；

3.4）然后于每孔中加入10ul CCK8，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)1~2h后，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度值。