[發明專利]用于定量檢測黃化曲葉病毒的特異引物及其應用

在審

• 申請號: 201710256617.3
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN107058626A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 李云龍;何曉青;王曉青;金一;王胤;孔維文;孫海;劉婷婷;胡彬;鄭建秋;劉正雄;李清波;雷喜紅;陳娟;王俊俠;張保常;張寧;孫艷艷;楊武群;張超;孫璐;張寶杰;李冬冬;周長青;吳繼宗;蔡樂;饒玉燕
• 申請（專利權）人: 北京市植物保護站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 文芳

1.一種用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物對，其特征在于，所述引物對含有序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列：

SEQ ID No.1：CCGTGACTATGTCGAAGCGA

SEQ ID No.2：GCTGTATGGGCTGTCGAAGT。

2.權利要求1所述的用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物對在定量檢測黃化曲葉病毒中的應用。

3.權利要求1所述的用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物對在制備用于定量檢測黃化曲葉病毒的試劑盒中的應用。

4.一種用于定量檢測黃化曲葉病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1所述的用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物對。

5.一種定量檢測黃化曲葉病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

對待測樣品進行PMA處理，然后進行提取DNA的操作，再以提取的DNA為模板，用權利要求1所述的用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物對進行PMA-qPCR擴增；以及，

直接對待測樣品進行提取DNA的操作，再以待測樣品的DNA為模板，用權利要求1所述的用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物對進行qPCR擴增；

根據上述的qPCR擴增和PMA-qPCR擴增的結果，計算活的黃化曲葉病毒的含量。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述根據qPCR擴增和PMA-qPCR擴增的結果，計算活的黃化曲葉病毒的含量的方法如下：

Y₁＝-3.242*lg(X₁)+36.4

Y₂＝-3.242*lg(X₂)+36.4

R＝X₂/X₁

其中，

“X₁”為qPCR擴增測得的黃化曲葉病毒的起始拷貝數；“Y₁”為qPCR擴增的Ct值；

“X₂”為PMA-qPCR擴增測得的活的黃化曲葉病毒的起始拷貝數；“Y₂”為PMA-qPCR擴增的Ct值；

“R”為活的黃化曲葉病毒占全部黃化曲葉病毒的比例。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述對待測樣品進行PMA處理的操作包括：

將PMA工作液加入經過粉碎處理的待測樣品中，使得PMA的終濃度達到5-20μg/mL，優選6-9μg/mL或8-12μg/mL或11-19μg/mL或12-18μg/mL或13-20μg/mL；然后光照處理3-8min，優選4-6min，進一步優選5min。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PMA工作液為用20％的DMSO配制成的1μg/μL的溶液。

9.根據權利要求6-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述對待測樣品進行PMA處理的操作在避光和低溫的條件下進行，優選在避光和冰上進行。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述qPCR擴增和PMA-qPCR擴增的程序為：首先95℃10min，然后95℃1min、57℃30s、72℃1min的條件下進行四十個循環。