[發(fā)明專利]用于定量檢測黃化曲葉病毒的特異引物及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710256617.3
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN107058626A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李云龍;何曉青;王曉青;金一;王胤;孔維文;孫海;劉婷婷;胡彬;鄭建秋;劉正雄;李清波;雷喜紅;陳娟;王俊俠;張保常;張寧;孫艷艷;楊武群;張超;孫璐;張寶杰;李冬冬;周長青;吳繼宗;蔡樂;饒玉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市植物保護(hù)站
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11246
• 代理人: 文芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原體檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于定量檢測黃化曲葉病毒的特異引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的致病菌的檢測方法，如生理生化指標(biāo)鑒定方法，細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定方法等都是依靠表型來鑒定致病菌；這些方法耗時長，靈敏度很低，而且準(zhǔn)確度差。

疊氮溴化丙錠(PMA)是一種能與DNA高度親和的熒光染料，它能穿過受損細(xì)胞膜，在可見光的照射下與DNA共價交聯(lián)，從而達(dá)到阻礙受損細(xì)胞中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的作用。有研究報(bào)道過PMA-qPCR方法結(jié)合檢測活的病原體含量，但僅限應(yīng)用于水體中(Fujimoto J,Watanabe K.Quantitative detection of viable bifidobacterium bifidum BF-1cells in human feces by using propidium monoazide and strain-specific primers[J].Applied and environmental microbiology,2013,79(7):2182-2188.；Van Frankenhuyzen J K,Trevors J T,Flemming C A,et al.Optimization,validation,and application of a real-time PCR protocol for quantification of viable bacterial cells in municipal sewage sludge and biosolids using reporter genes and Escherichia coli[J].Journal of industrial microbiology&biotechnology,2013,40(11):1251-1261.；Salam K W,El-Fadel M,Barbour E K,et al.A propidium monoazide–quantitative PCR method for the detection and quantification of viable Enterococcus faecalis in large-volume samples of marine waters[J].Applied microbiology and biotechnology,2014,98(20):8707-8718.；和Kim S,Ko G.Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria,MS2and murine norovirus[J].Letters in applied microbiology,2012,55(3):182-188.)。普通的qPCR方法雖然能夠?qū)χ虏【M(jìn)行定量，但不能區(qū)分致病菌的死活(張振家,郁繼華,王喜林.黃瓜細(xì)菌性角斑病防治試驗(yàn)初報(bào)[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1989,4:63-66.；仝鐵錚,吳舒旭,李丹,et al.基于PMA-定量PCR選擇性檢測技術(shù)的病原菌消毒特性研究[J].環(huán)境科學(xué),2011,32(4):1120-1126.)。有研究表明致病菌在死亡后數(shù)天甚至數(shù)周內(nèi)DNA都能夠保持完整(Josephson K,Gerba C,Pepper I.Polymerase chain reaction detection of nonviable bacterial pathogens[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(10):3513-3515.)，因此如何區(qū)分病原體的死活就成為分子檢測手段的巨大挑戰(zhàn)。

綜上所述，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中迫切需要構(gòu)建一種重復(fù)性好、耗時短、靈敏度高的致病菌的分子檢測方法，這對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防和控制疾病有著很重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種用于定量檢測黃化曲葉病毒的引物及其應(yīng)用。

本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的研究發(fā)現(xiàn)，通過將PMA染料與定量PCR結(jié)合，使用設(shè)計(jì)的特異性的引物，可以定量檢測作物(例如黃瓜)殘?bào)w中的活病原體的含量和全部的病原體含量，再經(jīng)過計(jì)算可以得到同一單位質(zhì)量組織內(nèi)活的黃化曲葉病毒病所占的百分比。因此，該方法的建立可以成為判斷在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中針對患病植株進(jìn)行處理的有效性的一種手段。