[發(fā)明專利]一種基因突變和融合基因陽性參考品的制備方法

在審

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• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN108728492A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 高勁松;張英杰;魏瀟;魏奇
• 申請（專利權）人: 遼寧琦潤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

本發(fā)明的目的在于提供一種基因突變和融合基因陽性參考品的制備方法，所述制備方法采用將外來基因整合到細胞基因組中的慢病毒或逆轉錄病毒作為載體，制備符合不同基因突變或融合基因的序列，經(jīng)測序驗證無誤后，通過病毒嵌入到細胞基因組DNA中，藥物篩選出帶有基因突變或融合基因的單克隆細胞系，從而獲得源源不斷的陽性參考品。其中所述的細胞系優(yōu)選為293T細胞系，所述的突變可以是單一基因單一突變位點、單一基因多個位點突變、多個基因多個位點突變，所述融合基因可以是單一的融合基因，也可以是多個串聯(lián)的融合基因；該方法具有快速、準確、簡單、成本低、靈敏度高、能大規(guī)模進行生產(chǎn)的優(yōu)點，有利于市場的使用和推廣。

技術領域

本發(fā)明屬于基因檢測領域，特別提供一種基因突變和融合基因陽性參考品的制備方法。

背景技術

眾所周知，基因診斷是近年來發(fā)展極為迅速的一個領域，在腫瘤的分子診斷和靶向治療、傳染病病原體確定及其他疾病個體化治療的基因型(SNP)檢測或分析時都需要用到基因檢測技術，因此，基因檢測的臨床需求越來越大。目前普遍采用的檢測方法如二代測序技術(Next-generation sequencing technology)、擴增阻礙突變系統(tǒng)(Amplificationrefractory mutation system，ARMS)-PCR、數(shù)字PCR(Digital PCR,dPCR)技術等，根據(jù)這些技術，正在開發(fā)相應基因檢測試劑盒，而所開發(fā)的試劑盒中不可避免的都需要有陽性參考品作為檢測時的陽性對照，因為基于臨床應用的試劑盒在開發(fā)過程中必須要有陽性對照樣本進行試劑盒的相應實驗，除了防止假陰性發(fā)生外，還需要對試劑盒的各項性能指標做出判斷和評價，在后續(xù)的試劑盒注冊審批過程中也需要有相應的陽性或陰性參考品進行注冊檢驗；所謂參考品，即具有一種或多種足夠均勻和確定了很好的特性，用以校準測量裝置、評級測量方法或給材料賦值的一種材料或物質(zhì)。

目前基因突變檢測試劑盒中最常見的陽性參考品是帶有相應突變位點的人工質(zhì)粒，但是，質(zhì)粒DNA不是組織細胞中的基因組DNA，它是人工制備的產(chǎn)物，分子量僅僅為3-4千堿基對，而待檢測的標本都是全基因組DNA，分子量為30億堿基對，在檢測的基質(zhì)上存在較大偏差，因此會導致一定的失真性，同時在制備和檢測時，質(zhì)粒很容易形成氣溶膠而污染環(huán)境，進而出現(xiàn)假陽性；陽性質(zhì)粒只有待檢測基因的突變位點，不能檢測出內(nèi)控和外控指標，因此以質(zhì)粒作為陽性標準欠缺完整性，另外，質(zhì)粒濃度低于一定量時其穩(wěn)定性不能保持24h，即不具備穩(wěn)定性。對于融合基因的檢測而言，質(zhì)粒作為陽性參考品存在的諸多不足，因為融合基因檢測的靶標，往往是mRNA，而質(zhì)粒是DNA，檢測mRNA必須要經(jīng)過逆轉錄成cDNA的步驟，檢測DNA則不需要這步，因此兩者的檢測步驟存在很大的差異，用質(zhì)粒做參考品同樣很容易出現(xiàn)假陰性或假陽性的問題，檢測的可靠性大打折扣。除了陽性質(zhì)粒作為陽性參考品外，一些容易得到的突變組織或細胞來源的基因組DNA也可以作為陽性參考品，但腫瘤基因突變或正常的SNP，其類型多樣，可謂千變?nèi)f化，受臨床樣本的稀有性和一系列社會學倫理學因素的制約，很難收集到足夠量的臨床樣本，加之腫瘤組織的異質(zhì)性，用Sanger測序的方法常常存在靈敏度的欠缺而發(fā)生混亂，因此，來自腫瘤組織或細胞的這種參考品受到極大限制，而普遍使用的質(zhì)粒參考品明顯是現(xiàn)在一些分子診斷試劑盒組份中的一個短板。

國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械評審中心對參考品有明確的要求，即參考品的基質(zhì)應與臨床被檢樣本使用相同的基質(zhì)，如完全相同基質(zhì)的樣本不易獲得，應采用盡可能與臨床被檢樣本基質(zhì)接近的樣本，這里提及的基質(zhì)，就是待檢測樣本中的基本構成物質(zhì)，如檢測血液中的病毒，其基質(zhì)當是血清或血漿，如檢測的是腫瘤基因突變，其基質(zhì)當是來自組織或細胞的基因組DNA，如檢測的是腫瘤融合基因，其基質(zhì)當是細胞RNA，即參考品和臨床檢測樣本中的被測物盡可能的一致。如果參考品的設置不合理或者存在缺陷，那就會造成整個產(chǎn)品的原材料選擇、生產(chǎn)工藝的確定和反應體系的組成均存在較大的問題，導致產(chǎn)品的質(zhì)量不能達到臨床使用的安全性和有效性，容易在臨床檢測過程中出現(xiàn)錯誤結果而影響臨床的診斷和治療。可見一個好的參考品對檢測試劑的生產(chǎn)企業(yè)是多么的重要，但現(xiàn)在國家還沒有基因突變和融合基因相關檢測試劑的參考標準品，這也是國家有關部門亟待解決的問題。