[發(fā)明專(zhuān)利]一種基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710255423.1
• 申請(qǐng)日: 2017-04-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108728492A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高勁松;張英杰;魏瀟;魏奇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 遼寧琦潤(rùn)生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽(yáng)晨創(chuàng)科技專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 21001
• 代理人: 張晨

1.一種基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)構(gòu)建相應(yīng)符合基因突變或融合基因序列的病毒質(zhì)粒

a.調(diào)出要檢測(cè)基因相應(yīng)突變位點(diǎn)上下游的基因組DNA序列或融合基因的mRNA序列；

b.在基因突變位點(diǎn)或融合基因的上下游選擇擴(kuò)增引物，并在引物的兩端分別添加與病毒載體上對(duì)應(yīng)的酶切點(diǎn)序列；

c.對(duì)基因突變位點(diǎn)或融合基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物和相應(yīng)的病毒載體進(jìn)行酶切純化；

d.酶切純化后的PCR產(chǎn)物和病毒質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)過(guò)熱休克細(xì)菌轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆篩選，質(zhì)粒抽提和基因測(cè)序，獲得序列完全符合基因突變和融合基因序列的重組質(zhì)粒；

(2)構(gòu)建帶有基因突變或融合基因的穩(wěn)定細(xì)胞系

a.病毒包裝質(zhì)粒和上述(1)制備的重組病毒質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞制備病毒上清；

b.藥物篩選出嵌入重組病毒基因序列的細(xì)胞系；

c.驗(yàn)證突變位點(diǎn)或融合基因，獲得基因突變或融合基因陽(yáng)性參考品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：(1)具體步驟如下：

取快速2XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液3μl、酶切后PCR產(chǎn)物2μl、酶切后病毒載體1μl、T4DNA連接酶1μl，離心混勻，放置室溫30分鐘，再取連接后產(chǎn)物2μl，加入20μl的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴半小時(shí)后，42℃熱休克30sec，然后加入200μl SOC培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)1小時(shí)，再將此培養(yǎng)物均勻涂布在含100μg/ml氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)板上，放置37℃孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：(1)具體步驟如下：

將病毒包裝質(zhì)粒和帶有突變位點(diǎn)或融合基因的慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染至準(zhǔn)備好的293T細(xì)胞，具體如下：

將1.0μg病毒包裝混合質(zhì)粒、1.0μg重組突變病毒質(zhì)粒、250μl無(wú)血清Opti MEM加入1.5ml滅菌EP管中輕柔混勻并室溫孵予5min；

將6μl脂質(zhì)體Lipofectamine 2000溶于250μl無(wú)血清Opti-MEM I培養(yǎng)基中，輕柔混勻并室溫孵育5min；

將質(zhì)粒溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻并室溫孵育20min；

在六孔板中，加入質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物；放置于37℃5％CO₂的孵箱中培養(yǎng)，24h后用新鮮的DMEM含10％FBS培養(yǎng)基換液，48-72h后收獲含病毒的上清，3000rpm離心20min，去除沉淀，病毒上清-80℃貯存或立即感染細(xì)胞。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：(2)具體步驟如下：

在新鮮的培養(yǎng)基中加入適量制備好的病毒上清，并加入終濃度為6μg/ml的polybrene，放置于37℃5％CO₂的孵箱中培養(yǎng)24h，加入終濃度為2μg/ml的puromycin處理殺滅未感染的細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：所述的載體為能將外來(lái)基因整合到基因組中的病毒載體，包括慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：所述的細(xì)胞系為293T細(xì)胞系。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：通過(guò)極限稀釋法篩選出的單個(gè)細(xì)胞在37℃5％CO₂的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)測(cè)序驗(yàn)證正確的細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得陽(yáng)性參考品。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：所述的細(xì)胞系是單一基因單一突變位點(diǎn)的細(xì)胞系、單一基因多個(gè)突變位點(diǎn)的細(xì)胞系和多個(gè)基因多個(gè)突變位點(diǎn)的細(xì)胞系，單一融合基因和多種融合基因的細(xì)胞系。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因突變和融合基因陽(yáng)性參考品的制備方法，其特征在于：通過(guò)本發(fā)明制備出堿基置換、移碼、缺失、插入突變、融合基因、染色體移位及其罕見(jiàn)突變的陽(yáng)性參考品。