[發明專利]一種A型賽尼卡谷病毒滅活疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710254431.4
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107184969B
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 董金杰;田波;呂宏亮;劉萍;陳苗苗;鄧瑞雪;張濤;王會寶;王凡;劉西蘭;景志忠;高世杰;王超英;張云德;殷宏;張永光
• 申請（專利權）人: 中農威特生物科技股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61K39/39;C12N15/85;C12N15/41;C12N7/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一種A型賽尼卡谷病毒滅活疫苗，其特征在于含有滅活后的豬A型賽尼卡谷病毒全病毒顆粒抗原以及佐劑，其中所述的豬A型賽尼卡谷病毒全病毒顆粒抗原是由豬A型賽尼卡谷病毒全長感染性cDNA克隆通過病毒拯救獲得的，所述的感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權利要求1所述的A型賽尼卡谷病毒滅活疫苗，其特征在于所述的佐劑為含有20-50g/L多聚賴氨酸羥甲基纖維素聚肌胞（Poly ICLC），0.1-0.5g/L的EDTA以及0.01-0.1g/L的吐溫-20的磷酸緩沖液，調節pH值 8.0。

3.如權利要求1所述的A型賽尼卡谷病毒滅活疫苗，其特征在于所述的佐劑為含有25g/L多聚賴氨酸羥甲基纖維素聚肌胞（Poly ICLC），0.2g/L的EDTA以及0.05g/L的吐溫-20的50mM磷酸緩沖液，調節pH值 8.0。

4.一種制備權利要求1-3任一項所述的A型賽尼卡谷病毒滅活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）豬A型賽尼卡谷病毒全病毒顆粒抗原的制備

（1）豬A型賽尼卡谷病毒的拯救

構建含有豬A型賽尼卡谷病毒的全長感染性cDNA克隆的表達載體，其中所述cDNA克隆的核苷酸序列如SED ID NO.1所示；

（2）豬腎細胞系IBRS-2用含10v/v%胎牛血清的MEM基礎培養基培養到70-90％鋪滿，將步驟（1）構建得到的表達載體轉染IBRS-2，37 °C，5% CO₂孵育箱培養，培養48小時后的上清移到ST細胞上繼續培養，觀察細胞病變效應，在感染后出現明顯細胞病變效應時收獲病毒，即為拯救得到的豬A型賽尼卡谷病毒；

（3）病毒的傳代適應

拯救得到的豬A型賽尼卡谷病毒經過ST細胞、MRC-5細胞的傳代適應培養獲得適應MRC-5細胞的豬A型賽尼卡谷病毒，然后接種BHK-21細胞進行傳代適應培養，獲得適應BHK-21細胞培養的豬A型賽尼卡谷病毒的病毒培養液；

（4）澄清

病毒培養液用8μm的聚丙烯預過濾器過濾，再經0.45μm和0.2μm的過濾器過濾澄清，測定病毒滴度；

（5）超濾透析

澄清的病毒液用100 KD 膜超濾透析；

（6）純化

透析后的病毒液加入MgCl₂，使其終濃度為 2 mM，按15 U/ml 加入核酸酶作用2小時，離心，進行不連續氯化銫密度梯度離心，然后進行連續氯化銫密度梯度離心，每步離心結束后，收集光柵區帶，用含有10v/v %甘油、50 mM HEPESpH 8.0的200 mM Tris–HCl冷透析緩沖液透析；

（7）滅活

純化的病毒用RPMI 1640稀釋，用雙乙亞胺滅活，用硫代磷酸鈉中和；

（8）透析

用100KDa 的膜濃縮至原體積的1/6，用含有150 mM NaCl 的PBS緩沖液透析，獲得A型賽尼卡谷病毒全病毒顆粒抗原；

2）佐劑的制備

向磷酸緩沖液中加入多聚賴氨酸羥甲基纖維素聚肌胞（Poly ICLC），EDTA以及吐溫-20，使其終濃度分別達到20-50g/L，0.1-0.5g/L以及0.01-0.1g/L，調節pH值 8.0；

3）疫苗制備

將獲得的A型賽尼卡谷病毒全病毒顆粒抗原加入所制備得到的佐劑中，使病毒蛋白量達到5-10μg/mL，按照0.5-1.0ml /頭份進行分裝。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述的表達載體是通過將SED ID NO.1所示的核苷酸序列克隆入pSVL載體中構建得到的。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述的不連續氯化銫密度梯度離心中采用的氯化銫的濃度為1.24g/ ml以及1.4 g/ ml，連續氯化銫密度梯度離心中采用的氯化銫的濃度為1.33 g /ml。