[發明專利]用于鑒定金錢白花蛇的特異性引物、試劑盒及鑒別方法

在審

• 申請號: 201710254137.3
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106834535A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 李建生
• 申請（專利權）人: 北京建生藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司11250
• 代理人: 李敏

技術領域

本發明屬于中藥材鑒定技術領域，具體涉及一種用于鑒定金錢白花蛇的特異性引物、試劑盒及鑒別方法。

背景技術

金錢白花蛇為《中國藥典》2015年版一部收載的一種常用藥材，來源于眼鏡蛇科動物銀環蛇(Bungarus multicinctus Blyth)的幼蛇干燥體，具有祛風、通絡、止痙的功效。臨床用于治療風濕頑痹，麻木拘攣，中風口眼斜，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風，麻風等病癥。

金錢白花蛇作為一種常用的名貴中藥材，主要分布于我國浙江、廣東、廣西、云南和貴州等省份。近年來，由于生態環境不斷地惡化以及金錢白花蛇產卵率較低等因素致使其藥材資源急劇減少，又鑒于其療效確切，使用量大，飼養條件和技術要求嚴格，導致金錢白花蛇價格節節攀升。在利益驅使下，一些不法商家以次充好，使得商品中常充斥著混雜和偽品。比較常見的偽品有赤鏈蛇、鉛色水蛇和金環蛇等。針對金錢白花蛇嚴重的造假情況，研究人員利用分子生物學PCR技術來對金錢白花蛇真偽進行鑒別，如中國專利文CN101613759A中公開的鑒定金錢白花蛇的PCR方法及其特異引物，通過對金錢白花蛇的CYTB基因片段設計引物并進行PCR特異性擴增、電泳檢測即可完成對樣品真偽的鑒別。然而上述方案中采用的引物進行擴增的產物分子量為565bp，分子量大，導致其電泳時間長，檢測效率低，并且鑒定結果準確度和靈敏度低、種屬特異性差，對于種屬相近的蛇鑒別困難。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題在于提供一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的特異性引物，采用所述引物鑒定中藥金錢白花蛇，鑒定結果準確、穩定、可靠、特異性強和靈敏度高，能夠在短時間內對大量待測中藥金錢白花蛇進行快速鑒定。

本發明要解決的第二個技術問題在于提供一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的試劑盒，采用所述試劑盒鑒定中藥金錢白花蛇，鑒定結果準確、穩定、可靠、特異性強和靈敏度高，能夠在短時間內對大量待測中藥金錢白花蛇進行快速鑒定。

本發明要解決的第三個技術問題在于提供一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的方法，采用所述方法鑒定中藥金錢白花蛇，鑒定結果準確、穩定、可靠、特異性強和靈敏度高，能夠在短時間內對大量待測中藥金錢白花蛇進行快速鑒定。

為此，本發明提供了一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的引物，所述引物序列如下：

上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；

下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。

本發明提供了一種用于鑒定中藥金錢白花蛇的試劑盒，含有所述的引物。

本發明所述的試劑盒，每支所述試劑盒包括各自獨立包裝的引物液部分和PCR反應液部分；所述PCR反應液部分含有用于進行PCR擴增的含Mg²⁺擴增緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶以及ddH₂O。

本發明提供了一種所述的引物或所述的試劑盒在鑒定中藥金錢白花蛇中的應用。

本發明提供了一種鑒定中藥金錢白花蛇的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測中藥金錢白花蛇的總DNA，備用；

(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，采用如下引物進行PCR擴增：

上游引物:5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；

下游引物:5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。

(3)測定步驟(2)中所得的PCR擴增產物的大小，若所述PCR擴增產物中含有100～250bp的DNA片段，則所述待測中藥金錢白花蛇為真；反之，則所述待測中藥金錢白花蛇為假。

所述的方法，所述步驟(2)中，所述PCR反應體系包括：

DNA模板，100ng，2μL；

上游引物，10μM，1μL；

下游引物，10μM，1μL；

2×EasyPCR SuperMix，10μL；

ddH₂O，8μL；

反應總體積為22μL。

(4)所述的方法步驟(2)中，PCR擴增程序如下：95℃預變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，進行30個循環，然后繼續72℃延伸5min，降溫至4℃，獲得的擴增產物4℃保存。所述的方法(3)中100～250bp的DNA片段為181bp。所述的方法181bp的DNA片段序列如SEQ.ID NO：3所示。

本發明技術方案，具有如下優點：