[發明專利]微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法

在審

• 申請號: 201710254059.7
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107422108A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 張海洋;巴一;王欣怡;鄧婷;劉銳
• 申請（專利權）人: 天津市腫瘤醫院
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;A61K49/00;A61K31/7088
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種抑制胃癌血管生成的方法。

背景技術

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，最新流行病學調查表明胃癌在中國的發病率位居第二，死亡率位居第四。與多數惡性腫瘤相同，胃癌的多種生物學行為不僅與癌細胞自身特征有關，還與其微環境息息相關，特別是需要不斷地形成新生血管以實現其所需營養物質的供應。因此，若能阻斷腫瘤血管生成的過程，則有可能在一定程度上抑制腫瘤的生長、侵襲與轉移。目前已經發現的與腫瘤血管生成相關的因子有很多，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用最為顯著。VEGF作用于其受體VEGFR，調節血管內皮細胞與基底膜間的相互作用，從而促進血管新生。研究顯示，對于行根治性手術的中早期胃癌患者，高水平的VEGF與腫瘤不良特征和總生存差密切相關；而對于接受化療的晚期胃癌患者，VEGF高表達者生存期較短、預后較差。

現階段針對VEGF抗血管生成的靶向藥物——貝伐單抗在胃癌患者中進行的臨床試驗——AVAGAST試驗顯示，貝伐單抗聯合化療用于晚期胃癌的一線治療并未顯著延長生存期，回顧分析其失敗原因可能與病例選擇、群體遺傳學或腫瘤生物學方面的地區差異有關，事先篩選恰當的標記物可能會改善試驗的有效率。而由于轉錄翻譯是個受多因素調控的復雜過程，基因水平的擴增或突變并不能全部體現為蛋白水平的異常表達。因此基于單抗的治療原理，靶向針對蛋白水平的VEGF，即使篩選出一定程度上相關的標記物，也只覆蓋了小部分VEGF在基因已發生擴增的群體。此外，單抗的制備過程成本高，耗時長，平均約3-6個月，患者的經濟負擔沉重；且貝伐單抗由中國倉鼠卵巢細胞表達系統產生，種間免疫反應較種內更為復雜。

發明內容

目的是克服以上技術缺陷，采用高效、廉價、人源，同時實現轉錄后調控，避免因轉錄后與翻譯過程出現基因沉默而縮小人群覆蓋范圍，影響疾病的診斷與治療。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明公開了一種抑制胃癌血管生成的方法，即以微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，具體包括微囊泡的提取、電子顯微鏡下觀察微囊泡的狀態、miRNA定量分析、蛋白提取及Western blot、ELISA、EdU增殖實驗、體外血管生成實驗和成瘤實驗以及尾靜脈注射微囊泡實驗。

(1)微囊泡的提取

人胚腎細胞HEK293T未經處理或經轉染miR-29a/c mimics/inhibitor、NC mimics/inhibitor后24-48小時，收集細胞培養液；室溫下3000轉/分，離心20分鐘后，4℃10,000g離心30分鐘，目的是為了去除細胞及細胞碎片；離心后取上清液，4℃110,000g超速離心60分鐘；后棄凈上清液，用適量的1×PBS重懸沉淀后，再次4℃110,000g超速離心60分鐘；棄凈上清液，用適量的1×PBS重懸沉淀后于-80℃保存備用，或直接加入待孵育細胞中或進行小鼠尾靜脈注射實驗。

(2)電子顯微鏡下觀察微囊泡的形態

將超速離心得到的微囊泡立即轉移到離心管后加入2.5％的戊二醛固定20分鐘；1×PBS清洗3次，每次10分鐘；1％鋨酸4℃冰箱固定1分鐘；經梯度丙酮脫水之后，將丙酮與Eponate12按1:1配制浸透液，然后將脫水后的微囊泡置于浸透液中浸透4小時；后將微囊泡用環氧樹脂Eponate12進行包埋，置于60℃烤箱中12小時；經切片后，用鉛鈾常規染色后，在電子顯微鏡下觀察，記錄電鏡下微囊泡的形態。

(3)miRNA定量分析

miRNA采用TaqMan熒光探針法：按16℃15min、42℃1h、85℃5min進行逆轉錄，95℃5min，95℃15s、60℃1min 40個循環進行RT-qPCR，定量分析miR-29a/c水平。

(4)蛋白提取及Western blot

使用裂解液(1.1X SDS lysis buffer，含蛋白酶抑制劑)于冰上提取蛋白，恒壓100V電泳，恒流250mA冰浴中轉膜3h，2％BSA封閉1h，后4℃搖床分別孵育一抗Anti-ERBB3、Anti-GAPDH過夜，次日TBST洗膜后分別孵育二抗羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP 1h，再次TBST洗膜后，曝光，并用ImageJ進行灰度分析。

(5)ELISA