[發明專利]微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法

在審

• 申請號: 201710254059.7
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107422108A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 張海洋;巴一;王欣怡;鄧婷;劉銳
• 申請（專利權）人: 天津市腫瘤醫院
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;A61K49/00;A61K31/7088
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

1.微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，包括微囊泡的提取、電子顯微鏡下觀察微囊泡的狀態、miRNA定量分析、蛋白提取及Western blot、ELISA、EdU增殖實驗、體外血管生成實驗和成瘤實驗以及尾靜脈注射微囊泡實驗。

2.根據權利1所述的微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述微囊泡的提取方法如下：

步驟(1)：人胚腎細胞HEK293T未經處理或經轉染miR-29a/c mimics/inhibitor、NC mimics/inhibitor后24-48小時，收集細胞培養液；

步驟(2)：將步驟(1)的培養液在室溫下，放入離心機，以3000轉/分的速度，離心20分鐘后，4℃、10000g離心30分鐘后，去除細胞及細胞碎片，離心后取上清液，4℃、110000g超速離心60分鐘超速離心60分鐘；后棄凈上清液，用適量的1×PBS重懸沉淀后，再次4℃110,000g超速離心60分鐘；棄凈上清液，得到微囊泡。

3.根據權利要求1所述的微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述電子顯微鏡下觀察微囊泡的狀態的方法如下：將步驟(2)得到的微囊泡立即轉移到離心管后加入2.5％的戊二醛固定20分鐘；1×PBS清洗3次，每次10分鐘；1％鋨酸4℃冰箱固定1分鐘；經梯度丙酮脫水之后，將丙酮與Eponate12按1:1配制浸透液，然后將脫水后的微囊泡置于浸透液中浸透4小時；后將微囊泡用環氧樹脂Eponate12進行包埋，置于60℃烤箱中12小時；經切片后，用鉛鈾常規染色后，在電子顯微鏡下觀察，記錄電鏡下微囊泡的形態。

4.根據權利要求1所述的微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，將步驟(2)得到的微囊泡采用TaqMan熒光探針法進行miRNA定量分析，按16℃15min、42℃1h、85℃5min進行逆轉錄，95℃5min、95℃15s、60℃1min 40個循環進行RT-qPCR，定量分析miR-29a/c水平。

5.根據權利要求1所述的微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述蛋白提取及Western blot的步驟如下:使用裂解液于冰上提取蛋白，恒壓100V電泳，恒流250mA冰浴中轉膜3h，2％BSA封閉1h，后4℃搖床分別孵育一抗Anti-ERBB3、Anti-GAPDH過夜，次日TBST洗膜后分別孵育二抗羊抗鼠 IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP 1h，再次TBST洗膜后，曝光，并用ImageJ進行灰度分析。

6.根據權利要求1所述的微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述ELISA的步驟如下，細胞經轉染后24-48小時，收集培液，低速離心后取上清分裝，-20℃保存備用；稀釋標準品至5000pg/ml，室溫靜置10分鐘，后倍比稀釋至2500、1250、625、312.5、156、78pg/ml；向96孔板每孔中加入100μl上述各個濃度稀釋的標準品和細胞上清液，37℃孵育1.5小時后，棄凈孔內液體；稀釋檢測液A100倍，每孔加100μl，37℃孵育1小時后，棄凈孔內液體；清洗后稀釋檢測液B 100倍，每孔加100μl，37℃1小時，棄凈孔內液體；清洗后每孔加入90μl底物溶液，37℃避光孵育顯色30分鐘；每孔加50μl終止液終止反應(藍色變成黃色)；用酶標儀測定每個孔在波長450nm的吸光度值，即OD值；根據標準品的OD值，對每種處理的細胞培養液中的VEGF的蛋白濃度進行定量分析。

7.根據權利要求1所述的微囊泡作為miRNA運輸載體抑制胃癌血管生成的方法，其特征在于，所述EdU增殖實驗的步驟如下，鋪24孔板，次日轉染，24h后按1000:1稀釋EdU試劑A，500μl/孔加至24孔板，4-6h后經PBS清洗，后按說明書步驟完成操作，于熒光顯微鏡下在RFP及DAPI通道分別采集圖像，并進行merge及統計分析。