[發(fā)明專利]檢測柑橘鐵螯合還原酶家族基因的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710253833.2 | 申請日： | 2017-04-18 |
| 公開（公告）號： | CN106834534B | 公開（公告）日： | 2020-09-15 |
| 發(fā)明（設計）人： | 姚利曉;陳善春;何永睿;許蘭珍;雷天剛;鄒修平;彭愛紅 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851;C12Q1/6895 |
| 代理公司： | 重慶信航知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50218 | 代理人： | 吳彬 |
| 地址： | 400712 重*** | 國省代碼： | 重慶;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 檢測 柑橘 鐵螯合 還原酶 家族 基因 方法 | ||
本發(fā)明公開了一種檢測柑橘鐵螯合還原酶家族基因的方法，包括步驟：1)選取1年生的資陽香橙、卡里佐枳橙和枳的實生苗用作組織表達分析的材料；2)提取各實生苗根、莖、葉組織的RNA；3)以步驟2)提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈；4)熒光定量PCR；5)采用2△Ct法分析試驗所得數(shù)據(jù)。本發(fā)明檢測柑橘鐵螯合還原酶家族基因的方法，通過特定的引物和反應體系，分別鑒定出了5種鐵螯合還原酶基因在各種柑橘的不同部位的表達情況，有利于研究柑橘的耐缺鐵特性。
技術領域
本發(fā)明涉及一種鐵螯合還原酶基因檢測技術領域，特別涉及一種檢測柑橘鐵螯合還原酶家族基因的方法。
背景技術
在植物中，鐵作為卟啉的主要構(gòu)成成分和許多重要輔酶的輔基成分，如血紅蛋白、過氧化物酶、黃素蛋白、鐵氧還蛋白等，直接參與光合作用、呼吸作用、氮素同化、激素合成、活性氧的產(chǎn)生和清除、抵御病原物入侵等過程。由于鐵是合成葉綠素所必需的元素，植物缺鐵會造成葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，葉綠素含量減少，光合速率降低，植株葉片失綠變黃、生長遲緩甚或死亡，造成農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重損失。
雖然地殼中鐵的含量豐富(約為5％)，但土壤中的有效鐵含量卻很低。植物吸收鐵的主要形式是還原鐵(Fe2+)，而在中性或偏堿的土壤中，鐵是以氧化態(tài)鐵(Fe3+)存在，能供植物利用的還原鐵(Fe2+)非常有限。Bienfaint、Romheld及Marscher等總結(jié)了高等植物在缺鐵脅迫過程中形成的兩種適應性機理——機理Ⅰ和機理Ⅱ。機理Ⅰ植物包括雙子葉植物和非禾本科的單子葉植物；機理Ⅱ植物僅包括單子葉禾本科植物。現(xiàn)有的研究證明，機理Ⅰ植物吸收鐵的機理是：先通過H+-ATPase向細胞外分泌H+，酸化土壤，促進根際周圍Fe3+的溶解，再利用鐵螯合還原酶(Ferric chelate reductase,FRO)將三價鐵(Fe3+)還原為亞鐵(Fe2+)，在鐵運載蛋白(iron-regulated transporter,IRT)的作用下將亞鐵(Fe2+)運輸?shù)礁毎卸@得鐵營養(yǎng)。
鐵螯合還原酶是機理Ⅰ植物吸收鐵的關鍵酶。在模式植物擬南芥中存在8個FROs的編碼基因，AtFRO2首先在擬南芥中被克隆出來，編碼蛋白具有8個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，在缺鐵誘導的根表皮中大量表達。AtFRO3在根和葉中都可表達，在缺鐵脅迫時，在擬南芥的側(cè)根、根尖、維管束部位大量表達。AtFRO6定位在細胞質(zhì)膜上，AtFRO7定位在葉綠體膜上，AtFRO8定位在線粒體膜上，AtFRO1和AtFRO4在擬南芥中的表達量很低。將擬南芥的鐵螯合還原酶基因AtFRO2和AtFRO6分別轉(zhuǎn)化大豆和煙草，提高了轉(zhuǎn)基因植物根和葉中鐵螯合還原酶活性，轉(zhuǎn)基因植物的葉綠素含量上升，對缺鐵脅迫的耐性增強。酵母的鐵螯合還原酶基因refre1在煙草和水稻中的異源表達也提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐缺鐵能力。
柑橘屬于鐵吸收利用機理I植物，西南大學裴炎課題組研究結(jié)果表明，在缺鐵脅迫條件下，與植物鐵吸收相關的鐵螯合還原酶活性在香橙中增加約20倍，而在枳中僅增加3倍，并克隆出資陽香橙鐵螯合還原酶基因FRO2；且香橙根系在鐵脅迫前后分泌質(zhì)子的能力顯著強于枳。我們分析發(fā)現(xiàn)柑橘中還存在4個新的鐵螯合還原酶基因，分別為FRO1、FRO3、FRO4和FRO5。鑒定這五種柑橘鐵螯合還原酶基因?qū)⒗诟涕倌腿辫F的研究。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種檢測柑橘鐵螯合還原酶家族基因的方法，以鑒定柑橘中的5種鐵螯合還原酶基因。
本發(fā)明檢測柑橘鐵螯合還原酶家族基因的方法，包括以下步驟：
1)選取資陽香橙、卡里佐枳橙和枳的根、莖和葉用作表達分析的材料；
2)分別提取資陽香橙、卡里佐枳橙和枳的根、莖、葉組織的RNA；
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