[發明專利]一種高性能M?MLV逆轉錄酶的制備方法

在審

• 申請號: 201710253825.8
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106906237A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 李京;高嵩;陳祉月;羅志丹;龔雪梅;張惠銘;張羽;潘綺雯
• 申請（專利權）人: 淮海工學院;江蘇愚公生命科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/12
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所32255
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及一種生物催化劑的制備方法，特別是一種高性能M-MLV逆轉錄酶的制備方法。

背景技術

現代生物醫學建立在分子生物學“中心法則”的基礎之上。通過基因表達研究基因功能是現代生物醫學的核心問題之一。由于基因表達產物RNA極易降解，因此絕大多數關于基因表達的研究都需要將RNA逆轉錄為cDNA來作為研究對象。特別是近年來，伴隨著高通量測序技術的飛速發展，RNA測序在生物醫學前沿研究中得到了廣泛的應用，在真核生物的基因表達調控研究、疾病發生機制研究和精準醫療方案確定、動植物遺傳育種等眾多方面都具有不可估量的潛力。而RNA測序同樣需要首先將模板RNA轉變為cDNA來構建測序文庫。在這些過程中，都需要一種極為重要的生物催化劑——逆轉錄酶。

逆轉錄酶（Reverse Transcriptase）是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成cDNA的酶。逆轉錄酶具有3種活性：RNA指導的DNA聚合酶活性，DNA指導的DNA聚合酶活性（這2種活性共用同一個活性中心），以及降解RNA-DNA雜合鏈中RNA的RNase H活性。在生物醫學領域，逆轉錄酶被廣泛用于合成第一鏈cDNA、制備cDNA文庫、RNA測序等。為此，最早發現逆轉錄酶的美國科學家特明（H. M. Temin）和巴爾的摩（D. Baltimore）共同獲得了1970年諾貝爾生理學或醫學獎。

合成cDNA的最大挑戰在于，在較低的溫度下單鏈RNA容易自身配對形成發夾等復雜二級結構，阻礙逆轉錄反應的進行；同時，逆轉錄酶自身具有的RNase H活性會降解模板RNA，導致合成的cDNA被截短。而較高的溫度能夠打開RNA的二級結構，有利于cDNA的合成。目前，人們仍然缺乏高效率熱穩定性逆轉錄酶作為工具，因此，尋找熱穩定性更高的逆轉錄酶，或者改造提升現在已經發現的逆轉錄酶的熱穩定性十分重要。

最常用于生物醫學工具酶的逆轉錄酶包括莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney Murine Leukemia virus，M-MLV）逆轉錄酶和禽骨髓母細胞瘤病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）逆轉錄酶。M-MLV逆轉錄酶由一條多肽鏈構成，包括N端聚合酶結構域和C端RNase H結構域，一般在37°C -42°C下工作，在高溫下會很快失活。AMV逆轉錄酶具有更高的最適反應溫度（45°C -50°C），但由于和M-MLV逆轉錄酶相比，其cDNA合成效率較低、RNase H活性較強，所以應用范圍較小。由于野生型M-MLV逆轉錄酶和AMV逆轉錄酶在反應溫度方面受限，科研人員對于它們的熱穩定性和cDNA合成效率的提升改造從未間斷。其中一個有效的改造是通過點突變將它們的RNase H活性去除。去除RNase H活性后，它們對于全長cDNA的合成有了很大改善，熱穩定性也有了一定提高。M-MLV逆轉錄酶由單體構成，結構比AMV逆轉錄酶（由2個亞基構成）更為簡單，因此也得到更多的改造嘗試。通過分子設計結合高通量篩選的方法，目前已獲得了熱穩定性高達60°C的M-MLV逆轉錄酶突變體。

在野生型M-MLV逆轉錄酶中引入大量隨機突變，并使用compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique技術進行高通量篩選，選出熱穩定性提升的突變體。現有報道的最高熱穩定性M-MLV逆轉錄酶耐熱能力為60°C。其缺陷在于：由于突變是隨機引入的，導致無效突變或失活突變過多，后期篩選工作量大且命中率低。篩選使用的compartmentalized ribosome display (CRD) evolution in vitro technique技術要使用無細胞表達體系，價格昂貴。現有報道的最高熱穩定性M-MLV逆轉錄酶耐熱能力為60°C，耐熱能力較低。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種分子理性設計與功能篩選相結合從而獲取高熱穩定性的M-MLV逆轉錄酶的制備方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種高性能M-MLV逆轉錄酶的制備方法，其特點是，其步驟如下：