[發(fā)明專利]一種高性能M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710253825.8
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106906237A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李京;高嵩;陳祉月;羅志丹;龔雪梅;張惠銘;張羽;潘綺雯
• 申請（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院;江蘇愚公生命科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/12
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務(wù)所32255
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種高性能M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的制備方法，其特征在于，其步驟如下：

（1）突變體克隆構(gòu)建：野生型M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的基因序列CCA64130.1通過基因合成獲得，合成至克隆載體pUC57上，產(chǎn)生pUC57-M-MLV質(zhì)粒；合成序列包括5’端添加的NheI酶切位點(diǎn)和3’端添加的TAA終止密碼子以及EcoRI酶切位點(diǎn)；pUC57-M-MLV質(zhì)粒經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切后，帶有M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因的片段以T4 DNA Ligase連接至相同限制性內(nèi)切酶酶切后的pET-28b載體上，使M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶基因的表達(dá)框與載體上的組胺純化標(biāo)簽6xHis的表達(dá)框一致；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，然后提取獲得重組質(zhì)粒pET28b-M-MLV，并經(jīng)測序確認(rèn)序列正確；該質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生N端融合6xHis純化標(biāo)簽的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的構(gòu)建以質(zhì)粒pET28b-M-MLV為原始模板，在突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，使用點(diǎn)突變試劑盒KOD Site-Directed Mutagenesis Kit定向引入點(diǎn)突變；每輪定向突變只能引入1個(gè)單點(diǎn)突變，多點(diǎn)突變的構(gòu)建經(jīng)過多輪單點(diǎn)定向突變完成；所構(gòu)建的突變體質(zhì)粒序列均經(jīng)過測序確認(rèn)，得到17個(gè)突變體質(zhì)粒；

（2）突變體的篩選：將編號分別為1-18的野生型pET28b-M-MLV和17個(gè)突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21 (DE3) RIPL感受態(tài)細(xì)胞中，并在含卡那霉素和氯霉素兩種抗生素的平板上以30℃－40℃條件培養(yǎng)過夜；挑取平板上的單克隆接種到含卡那霉素和氯霉素兩種抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃ -40℃、150rpm－250 rpm的搖床中活化培養(yǎng)至OD值為0.4－0.6，再加入終濃度為0.1－0.3 mM的誘導(dǎo)劑IPTG在16℃下以150rpm－250 rpm搖動培養(yǎng)，誘導(dǎo)突變酶表達(dá)；IPTG誘導(dǎo)后的發(fā)酵液離心收集菌體；菌體以B-PER細(xì)菌蛋白提取試劑充分重懸后，靜置，渦旋后低溫離心取上清，獲得突變酶粗提液；對不同突變酶粗提液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，觀察有無目的蛋白的表達(dá)；選擇有蛋白表達(dá)的突變酶粗提液，在不同溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄活性篩選：以番茄總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；向含1 μg RNA模板的反應(yīng)管中按順序依次加入如下反應(yīng)組分：1 μl oligo(dT)₂₀引物、4 μl 5X M-MLV First Strand Buffer、1 μl 0.1 M DTT、1 μl Ribonuclease Inhibitor、1 μl dNTP Mix，以及0.5 μl突變酶粗提液，用Nuclease-free Water將總體積補(bǔ)至20 μl，在37℃－60℃不同反應(yīng)溫度下反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，于80℃－90℃孵育5s－15 s以終止反應(yīng)，使用0.5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板，并使用高保真KOD DNA聚合酶以及1對β-Actin基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增情況；觀察到PCR擴(kuò)增條帶則認(rèn)為突變酶粗提液具有逆轉(zhuǎn)錄活性；

（3）逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的表達(dá)與純化：將活性篩選結(jié)果陽性的突變體在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.6-0.8，加入終濃度為0.15mM－0.25 mM的IPTG，在15℃－17℃，180rpm－220rpm培養(yǎng)10－20小時(shí)，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；將IPTG誘導(dǎo)后的發(fā)酵液以8000g離心15－25min收集菌體；菌體以Ni柱結(jié)合緩沖液充分重懸后，以細(xì)胞高壓破碎儀破碎，再以43000g低溫離心20－40 min，取上清以Ni親和層析純化柱純化并分步收集，將單管收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測；Ni親和層析過程中使用的緩沖液包括：平衡緩沖液、漂洗緩沖液和梯度洗脫緩沖液；Ni親和層析的洗脫峰以AKTA系統(tǒng)配套Superdex200層析柱進(jìn)行分子篩層析，收集洗脫峰并透析至貯存緩沖液，儲存于-80°C；整個(gè)純化過程在冰上或4°C進(jìn)行；得到M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。