[發(fā)明專利]一種適配體過(guò)氧化物模擬酶可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710253103.2
• 申請(qǐng)日: 2017-04-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107084976B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳世嘉;段諾;王周平;劉麗紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/65;G01N33/531;G01N33/569
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于適配體識(shí)別和過(guò)氧化物模擬酶可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。利用溶劑熱法制備得到具有過(guò)氧化物酶活性的鐵酸鋅/還原氧化石墨烯納米模擬酶，通過(guò)以固定于微孔板的適配體1為捕獲探針，以適配體2修飾的鐵酸鋅/還原氧化石墨烯為過(guò)氧化物模擬酶，當(dāng)體系中存在沙門(mén)氏菌時(shí)，適配體與沙門(mén)氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，從而形成(微孔板)適配體1?沙門(mén)氏菌?適配體2/鐵酸鋅/還原氧化石墨烯的三明治夾心結(jié)構(gòu)，加入顯色底物TMB(3,3',5,5'?四甲基聯(lián)苯胺)?H₂O₂，鐵酸鋅/還原氧化石墨烯過(guò)氧化物模擬酶可催化H₂O₂氧化TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適配體過(guò)氧化物模擬酶可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

沙門(mén)氏菌是一種腸道桿菌致病菌，在自然界中廣泛存在，特別容易污染水源、食品及畜產(chǎn)品。食用了感染沙門(mén)氏菌的食物會(huì)引發(fā)突發(fā)性食物中毒，出現(xiàn)傷寒、急性腸胃炎、菌血癥和敗血癥等癥狀，對(duì)于人類和動(dòng)物的健康均構(gòu)成極大危害。各國(guó)政府機(jī)構(gòu)普遍提出該致病菌的限量要求，我國(guó)規(guī)定在乳制品、肉制品、水產(chǎn)制品、即食蛋制品等11類食品中沙門(mén)氏菌不得被檢出。因此建立一種快速、準(zhǔn)確、便捷的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法，對(duì)于保障食品安全具有重要意義。

傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)方法等。平板計(jì)數(shù)法因其檢驗(yàn)程序較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。分子生物學(xué)技術(shù)，雖然能縮短檢驗(yàn)時(shí)間，但前期需要提取細(xì)菌總DNA，且靈敏度仍然不高；免疫學(xué)方法如酶聯(lián)免疫吸附分析法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于肉眼觀察等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而其識(shí)別分子-抗體，制備成本高，周期長(zhǎng)，且穩(wěn)定性不佳；其信號(hào)分子-辣根過(guò)氧化酶(HRP)，屬天然酶，活性高但穩(wěn)定性欠佳，易受環(huán)境因素的影響，從而限制了酶聯(lián)免疫檢測(cè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服上述不足之處，以適配體作為識(shí)別分子，以納米模擬酶催化底物顯色，將適配體和納米生物技術(shù)及可視化檢測(cè)等諸多技術(shù)的優(yōu)勢(shì)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，建立一種簡(jiǎn)單快捷而又具有極高靈敏度和特異性的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案，一種適配體過(guò)氧化物模擬酶可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，將生物素化適配體固定于包被有親和素的微孔板中作為捕獲探針，同時(shí)制備鐵酸鋅/還原氧化石墨烯過(guò)氧化物模擬酶，并將另一條沙門(mén)氏菌的適配體固定于鐵酸鋅/還原氧化石墨烯表面作為信號(hào)探針，當(dāng)加入沙門(mén)氏菌時(shí)，捕獲探針和信號(hào)探針中的適配體均與沙門(mén)氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，形成(微孔板)適配體-沙門(mén)氏菌-適配體/鐵酸鋅/還原氧化石墨烯的三明治夾心結(jié)構(gòu)，最后加入顯色底物TMB-H₂O₂，鐵酸鋅/還原氧化石墨烯復(fù)合納米材料可以作為過(guò)氧化物模擬酶，催化H₂O₂氧化TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)。具體檢測(cè)原理如圖1所示。本方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體方法：

一種適配體過(guò)氧化物模擬酶可視化檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，包括以下步驟：

1)捕獲探針的制備：100μL，20(μg/mL)的親和素于微孔板中4℃包被過(guò)夜；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；接著加入200μL生物素化的適配體1(200nM)于37℃孵育1h；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min；最后加入200μL 1％的BSA于37℃孵育1h封閉孔板；倒出，每孔加入200μL PBS(10mM，pH 7.4)洗板3次，每次1min，以防后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟中產(chǎn)生非特異性吸附。

2)信號(hào)探針的制備：