[發(fā)明專利]一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振分析方法

在審

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• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107121416A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹慧;艾青;張宇軍;徐斐;袁敏;于勁松;葉泰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海理工大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司31001
• 代理人: 吳寶根

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，涉及一種功能性成分的活性檢測方法，具體來說是一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法。

背景技術(shù)

免疫活性肽通常是指外源性基因重組或人工化學(xué)合成的耐受原表位肽或變構(gòu)肽。作為一種短肽，免疫活性肽具有來源廣、活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，在功能性食品、保健品及醫(yī)療藥品等領(lǐng)域中有著廣大的應(yīng)用前景。目前，免疫活性肽絕大部分來源于天然產(chǎn)物，在這些免疫活性肽的篩選過程中，淋巴細(xì)胞增殖法是常用的免疫活性檢測方法。該法操作過程繁瑣，檢測時間長，靈敏度低，檢測結(jié)果受到淋巴細(xì)胞來源、操作人員專業(yè)水平及操作環(huán)境等諸多因素的干擾，因而迫切需要發(fā)展一種更加簡單且準(zhǔn)確的。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，免疫活性肽存在不同的抗原表位，當(dāng)免疫活性肽被抗原提呈細(xì)胞(APC)識別時，這些表位能與APC表面的MHC類分子發(fā)生特異性結(jié)合，形成MHC類分子-免疫活性肽復(fù)合物，該復(fù)合物與T細(xì)胞表面受體(TCR)分子發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而激活自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使其活化、增殖。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法，所述的這種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測免疫活性肽免疫活性的方法操作過程繁瑣，檢測時間長，靈敏度低的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法，其特征在于包括如下步驟：

1)一個確定流感病毒熒光標(biāo)記物工作濃度的步驟，用100mmol/L、pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按5倍比例稀釋流感病毒熒光標(biāo)記物，取200μL于96孔板中，37℃孵育72h，用SpectraMax M5酶標(biāo)儀在吸收波長為492nm，發(fā)射波長為520nm下檢測熒光偏振光強(qiáng)度，以達(dá)到穩(wěn)定偏振值所對應(yīng)的最小濃度作為流感病毒熒光標(biāo)記物的工作濃度；

2)一個確定HLA-DRB₄復(fù)合蛋白工作濃度的步驟，用100mmol/L、pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀釋HLA-DRB₄復(fù)合蛋白溶液；取100μL HLA-DRB₄復(fù)合蛋白溶液于96孔板，然后加入流感病毒熒光標(biāo)記物和100mmol/L、pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使流感病毒熒光標(biāo)記物終濃度為步驟(1)確定的工作濃度，同時使得96孔板中的體積為200ul；將反應(yīng)溶液混勻后于37℃孵育72min，用SpectraMax M5酶標(biāo)儀在吸收波長為492nm、發(fā)射波長為520nm的條件下檢測熒光偏振光強(qiáng)度，以最大偏振值60％對應(yīng)的HLA-DRB₄復(fù)合蛋白濃度作為其最佳工作濃度；

3)一個建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線的步驟，以流感病毒素濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)合率為縱坐標(biāo)建立免疫活性肽的結(jié)合率曲線，結(jié)合率的計(jì)算公式如下：

式中：FP_樣品為待檢測樣品的熒光偏振值，F(xiàn)P_{標(biāo)記肽}為流感病毒熒光標(biāo)記物標(biāo)記肽對應(yīng)的熒光偏振值，F(xiàn)P_無競爭為流感病毒熒光標(biāo)記物熒光標(biāo)記肽和HLA-DRB₄復(fù)合蛋白的熒光偏振值；

4)一個制備免疫活性肽樣品的步驟，稱取200mgII型膠原蛋白，加雙蒸水配置成1mg/mL的溶液，置于溫度為50℃的酶反應(yīng)器中，按加酶量為80U/ml加入中性蛋白酶酶解3h，蛋白酶的酶活為10000U/g，收集酶解液，將酶解液于40℃、100rpm的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮；使其終濃度為4mg/ml；

5)一個檢測免疫活性肽免疫活性的步驟，將濃度為4mg/ml的免疫活性肽樣品用雙蒸水按100倍稀釋倍數(shù)稀釋成系列濃度，取總體積為200μL的溶液，該溶液中含有50μL的流感病毒熒光標(biāo)記物、50μL的HLA-DRB4復(fù)合蛋白溶液以及100μL的免疫活性肽溶液，所述的流感病毒熒光標(biāo)記物的濃度符合步驟1)的結(jié)果，所述的HLA-DRB4復(fù)合蛋白溶液的濃度符合步驟2)的結(jié)果，將該溶液置于96孔板中，混勻后37℃孵育72min，再用SpectraMax M5酶標(biāo)儀在吸收波長為492nm、發(fā)射波長為520nm下檢測其熒光偏振光強(qiáng)度，然后計(jì)算免疫活性肽IC50值，其中，IC50值定義為在競爭性試驗(yàn)中結(jié)合率為50％時的免疫活性肽的濃度。