[發明專利]一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振分析方法

在審

• 申請號: 201710252890.9
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107121416A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 曹慧;艾青;張宇軍;徐斐;袁敏;于勁松;葉泰
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司31001
• 代理人: 吳寶根

1.一種用于免疫活性肽免疫活性檢測的熒光偏振方法，其特征在于包括如下步驟：

1)一個確定流感病毒熒光標記物工作濃度的步驟，用100mmol/L、pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按5倍比例稀釋流感病毒熒光標記物，取200μL于96孔板中，37℃孵育72h，用SpectraMax M5酶標儀在吸收波長為492nm，發射波長為520nm下檢測熒光偏振光強度，以達到穩定偏振值所對應的最小濃度作為流感病毒熒光標記物的工作濃度；

2)一個確定HLA-DRB₄復合蛋白工作濃度的步驟，用100mmol/L、pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液按1:2、1:4、1:8、1:80和1:800的比例稀釋HLA-DRB₄復合蛋白溶液；取100μL HLA-DRB₄復合蛋白溶液于96孔板，然后加入流感病毒熒光標記物和100mmol/L、pH5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，使流感病毒熒光標記物終濃度為步驟(1)確定的工作濃度，同時使得96孔板中的體積為200ul；將反應溶液混勻后于37℃孵育72min，用SpectraMax M5酶標儀在吸收波長為492nm、發射波長為520nm的條件下檢測熒光偏振光強度，以最大偏振值60％對應的HLA-DRB₄復合蛋白濃度作為其最佳工作濃度；

3)一個建立免疫活性肽的結合率曲線的步驟，以流感病毒素濃度為橫坐標，結合率為縱坐標建立免疫活性肽的結合率曲線，結合率的計算公式如下：

式中：FP_樣品為待檢測樣品的熒光偏振值，FP_標記肽為流感病毒熒光標記物標記肽對應的熒光偏振值，FP_無競爭為流感病毒熒光標記物熒光標記肽和HLA-DRB₄復合蛋白的熒光偏振值；

4)一個制備免疫活性肽樣品的步驟，稱取200mgII型膠原蛋白，加雙蒸水配置成1mg/mL的溶液，置于溫度為50℃的酶反應器中，按加酶量為80U/ml加入中性蛋白酶酶解3h，蛋白酶的酶活為10000U/g，收集酶解液，將酶解液于40℃、100rpm的旋轉蒸發儀中濃縮，使其終濃度為4mg/ml；

5)一個檢測免疫活性肽免疫活性的步驟，將濃度為4mg/ml的免疫活性肽樣品用雙蒸水按100倍稀釋倍數稀釋成系列濃度，取總體積為200μL的溶液，該溶液中含有50μL的流感病毒熒光標記物、50μL的HLA-DRB4復合蛋白溶液以及100μL的免疫活性肽溶液，所述的流感病毒熒光標記物的濃度符合步驟1)的結果，所述的HLA-DRB4復合蛋白溶液的濃度符合步驟2)的結果，將該溶液置于96孔板中，混勻后37℃孵育72min，再用SpectraMax M5酶標儀在吸收波長為492nm、發射波長為520nm下檢測其熒光偏振光強度，然后計算免疫活性肽IC50值，其中，IC50值定義為在競爭性試驗中結合率為50％時的免疫活性肽的濃度。