[發明專利]一種在細胞微囊泡表面修飾配體的方法

有效

• 申請號: 201710252548.9
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107022516B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 田田;高雋;王靜;王梅;張卉馨;寇曉林
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

本發明一種在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，包括如下步驟：(a)在細胞微囊泡表面連接二苯基環辛炔；(b)去除游離的二苯基環辛炔；(c)在細胞微囊泡表面的二苯基環辛炔上連接疊氮基修飾的配體；(d)對修飾好的細胞微囊泡進行提純。與現有技術相比，本方法節省時間，過程簡便，反應效率高，對配體的類型較少限制，同時能最大限度保持細胞微囊泡的生理活性。有利于增強細胞微囊泡的治療效果。

技術領域

本發明涉及在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

細胞微囊泡是人、動物、植物或微生物的細胞自動分泌釋放的或破碎后獲得的，具有脂質膜結構的，直徑從幾十納米到幾微米不等的囊泡。包括細胞外囊泡(Extracellularvesicle)、微囊泡(Microvesicle)、外泌體(Exosome)、調亡小體(Apoptotic body)、脫落囊泡(Shedding vesicle)、微粒(Microparticle)。細胞微囊泡攜帶有生物活性的蛋白質、脂質、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、非編碼RNA(ncRNA)以及DNA片段。并且能夠將這些活性分子傳遞給受體細胞，調節靶細胞、組織和器官的生物功能。某些類型的細胞，如間充質干細胞，產生的細胞微囊泡含有多種能夠保護受損組織，促進生長和修復，以及調節免疫功能的活性生物分子。注射入體內之后可以減少損傷、抑制炎癥、促進組織再生和功能恢復。同時，利用電穿孔、化學穿孔、超聲等方法還能夠將人工合成的小干擾RNA(siRNA)、miRNA、化療藥物裝載入細胞微囊泡，使其成為一種藥物載體。因此細胞微囊泡是一種新型的生物治療方法和遞送載體。現已在動物模型上驗證細胞微囊泡能夠促進血管生成、降低炎癥反應、促進神經再生、減少心肌和大腦缺血損傷、保護急性腎損傷和肺損傷、治療糖尿病和神經退行性疾病。然而，靜脈注射的細胞微囊泡很快被肝、脾等網狀內皮系統(RES)所吞噬和清除，較少到達靶器官。因此，通過表面修飾配體的方法增強其靶向性、體內穩定性和組織穿透性，以及降低血漿清除率具有重要意義。

目前的方法包括工程化供體細胞和膜插入兩大類方法，都具有較多步驟，操作復雜、費時。其中，工程化供體細胞的方法需要專門的生物學技術對細胞進行處理，無法修飾任意類型的配體，也不能對體液來源的細胞微囊泡進行修飾。膜插入的方法可能對細胞微囊泡原本的膜結構和理化性質產生較大影響，插入效率較難控制，游離的配體較難去除。因此，相關方面的研究和應用進展受到很大限制。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種在細胞微囊泡表面修飾配體的快速、高效的方法。本發明在細胞微囊泡表面修飾各種配體，有利于對其治療作用進行進一步研究，有利于加速臨床應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種在細胞微囊泡表面修飾配體的方法，包括如下步驟：

(a)在細胞微囊泡表面連接二苯基環辛炔(Dibenzocyclooctyl，DBCO)；

(b)去除游離的二苯基環辛炔；

(c)在細胞微囊泡表面的二苯基環辛炔上連接疊氮基修飾的配體；

(d)對修飾好的細胞微囊泡進行提純。

其中，所述細胞微囊泡為人、動物、植物或微生物的細胞所分泌或破碎后獲得的，具有脂質膜結構的，直徑從幾十納米到幾微米不等的囊泡。

其中，所述細胞微囊泡為細胞外囊泡(Extracellular vesicle)、微囊泡(Microvesicle)、外泌體(Exosome)、調亡小體(Apoptotic body)、脫落囊泡(Sheddingvesicle)或微粒(Microparticle)。