[發(fā)明專利]一種在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710252548.9
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107022516B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田田;高雋;王靜;王梅;張卉馨;寇曉林
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(a)在細(xì)胞微囊泡表面連接二苯基環(huán)辛炔；

(b)去除游離的二苯基環(huán)辛炔；

(c)在細(xì)胞微囊泡表面的二苯基環(huán)辛炔上連接疊氮基修飾的配體；

(d)對修飾好的細(xì)胞微囊泡進(jìn)行提純；

步驟(a)中，利用雙功能化分子將二苯基環(huán)辛炔共價偶聯(lián)到細(xì)胞微囊泡表面天然存在的氨基末端上；其中，所述的雙功能化分子為同時帶有二苯基環(huán)辛炔和N-羥基琥珀酰亞胺的分子；

步驟(a)中，PBS緩沖液重懸細(xì)胞微囊泡，按照每10¹²細(xì)胞微囊泡數(shù)量加入1nmol～20nmol雙功能化分子的比例混合，在室溫下反應(yīng)2～12小時；

步驟(c)中，利用疊氮化的配體與細(xì)胞微囊泡表面的二苯基環(huán)辛炔進(jìn)行無銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，從而將配體共價偶聯(lián)在細(xì)胞微囊泡表面；

步驟(c)中，步驟(b)的產(chǎn)物與疊氮化的配體在PBS緩沖液中混勻，在4℃下反應(yīng)4～24小時，其中，每10¹²囊泡微粒數(shù)加入0.1nmol～5nmol疊氮化的配體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，所述細(xì)胞微囊泡為人、動物、植物或微生物的細(xì)胞所分泌或破碎后獲得的，具有脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，所述細(xì)胞微囊泡為細(xì)胞外囊泡、微囊泡、外泌體、調(diào)亡小體、脫落囊泡或微粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，所述的雙功能化分子為DBCO-sulfo-NHS、或DBCO-NHS、或DBCO-PEG4-NHS。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，步驟(b)中，通過超濾去除沒有偶聯(lián)在細(xì)胞微囊泡上的雙功能化分子。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，步驟(c)中，所述配體為肽、蛋白質(zhì)、核酸或高分子化合物。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，所述的疊氮化的配體是將Azide-sulfo-NHS、或Azide-NHS、或Azide-PEG4-NHS與配體按照摩爾比10：1混合，在室溫下反應(yīng)2～12小時，獲得疊氮化的配體。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在細(xì)胞微囊泡表面修飾配體的方法，其特征在于，步驟(d)中，使用超速離心的方法對修飾好的細(xì)胞微囊泡進(jìn)行提純。