[發(fā)明專利]家蠅酚氧化酶原激活酶1基因及其重組蛋白與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710252378.4
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN107418961A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李殿香;欒園園;王蕾;呂桐銳
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12Q1/68
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所37218
• 代理人: 張世靜

1.一種家蠅酚氧化酶原激活酶1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠅酚氧化酶原激活酶1基因，其特征在于，其編碼的重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一種權(quán)利要求1或2所述的家蠅酚氧化酶原激活酶1基因的克隆方法，其特征在于，

（1）總RNA的提取：常規(guī)方法提取家蠅總RNA；

（2）cDNA第一鏈合成：利用Smart F、Oligoanchor R作為反轉(zhuǎn)錄的引物，先配成12 μL體系:

總RNA 5μg 10 μL，

Smart F 100μM 1μL，

Oligoanchor R 100μM 1μL；

混合均勻，瞬時(shí)離心；70℃水浴5 min，冰浴2 min，向以上體系中繼續(xù)加入其他組分：

5×First－Srand Reaction Buffer 4μL，

RNase inhibitor 20u/mL1μL，

dNTP Mix 10mM 2μL；

輕輕混勻，瞬時(shí)離心；37℃水浴5 min；

加200U/mL 1 μL反轉(zhuǎn)錄酶SupermoⅢ M-MLV ，至終體積20 μL；輕輕混勻，瞬時(shí)離心，50℃水浴60 min；

70℃水浴5 min，冰浴2 min，終止第一鏈cDNA合成；

（3）PCR反應(yīng)：依據(jù)家蠅轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene序列設(shè)計(jì)特異引物3’端擴(kuò)增-F與3’anchor R；

25 μL PCR反應(yīng)液配制方案：

滅菌水 18.4μL，

10×Taq Buffer 2.5μL，

dNTP Mix 2.5mM 2.0μL，

3’anchor R 10μM0.5μL，

3’端擴(kuò)增-F 10μM0.5μL，

Taq 5U/μL0.1 μL，

cDNA模板 1.0μL；

混勻以上PCR反應(yīng)液，置于PCR儀上，PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min，進(jìn)入以下循環(huán)：94℃30 sec；55℃，30 sec；72℃，80 sec；重復(fù)30次后，72℃延伸10 min；

（4）PCR產(chǎn)物純化：PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切出目標(biāo)帶，用膠回收試劑盒進(jìn)行純化；

（5）mdPAP1基因cDNA克隆：將純化產(chǎn)物連入T載體pMD-19-T，構(gòu)建重組質(zhì)粒；反應(yīng)液及用量為：

純化PCR產(chǎn)物4μL ，

2×ligation buffer 5μL，

pMD-19-T 載體1μL；

混勻反應(yīng)液，16℃過夜連接；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含100μg/mL氨芐青霉素、0.2μg/mL X-gal、0.1mol/mL IP TG LB平板上37℃過夜培養(yǎng)；從轉(zhuǎn)化板上挑取白色克隆，經(jīng)PCR檢測陽性后，接種于含有100 mg/mL氨芐青霉素的5mL LB試管中，37℃，250 rpm過夜振蕩培養(yǎng)，10000 rpm離心菌液3 min，留細(xì)胞，用微量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序，將所得序列與基因庫序列比較，確定擴(kuò)增的該基因的3‘端序列正確；

將擴(kuò)增的該基因的3‘端序列與Unigene序列拼接一起，就獲得了SEQ ID NO.1所示mdPAP1基因全長cDNA的核苷酸序列；

所述Smart F的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述Oligoanchor R的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述3’端擴(kuò)增-F的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述3’anchor R的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述Unigene的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.家蠅酚氧化酶原激活酶1基因在制備免疫性藥物中的應(yīng)用。

5.家蠅酚氧化酶原激活酶1基因表達(dá)的重組蛋白在激活MdproPO的酶活性中的應(yīng)用。