[發(fā)明專利]家蠅酚氧化酶原激活酶1基因及其重組蛋白與應用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710252378.4 | 申請日： | 2017-04-18 |
| 公開（公告）號： | CN107418961A | 公開（公告）日： | 2017-12-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李殿香;欒園園;王蕾;呂桐銳 | 申請（專利權(quán)）人： | 濟南大學 |
| 主分類號： | C12N15/53 | 分類號： | C12N15/53;C12N9/02;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 濟南泉城專利商標事務所37218 | 代理人： | 張世靜 |
| 地址： | 250022 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 家蠅 氧化酶 激活 基因 及其 重組 蛋白 應用 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種家蠅酚氧化酶原激活酶1（mdPAP1）基因及其表達的重組蛋白與應用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
家蠅同其他昆蟲一樣，缺乏獲得性免疫，對入侵病原的防御完全依靠先天免疫。昆蟲的先天免疫包括細胞免疫和體液免疫兩部分。酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase-activated system，proPO系統(tǒng)）是昆蟲重要的體液免疫成分，該系統(tǒng)的激活是一個絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應：上游的絲氨酸蛋白酶水解下游酶的酶原，活化的酶再去激活下一個酶的酶原，最終由酚氧化酶原激活酶（proPO-activating enzyme，PAP）直接把酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）激活為酚氧化酶（phenoloxidases，PO），從而對病原入侵做出最快速的免疫應答，不僅影響昆蟲的黑色素合成，還影響其發(fā)育與壽命，并與昆蟲抗菌肽的產(chǎn)生有關(guān)，在昆蟲的病原識別與防御中起重要作用。
獲得家蠅酚氧化酶原激活酶1（mdPAP1）基因及其重組蛋白，對查明家蠅proPO系統(tǒng)的激活機制及家蠅proPO系統(tǒng)激活在病原防御中的功能有重要意義，有助于加深認識家蠅乃至一系列病媒昆蟲的獨特免疫機制，還有助于發(fā)現(xiàn)抵御病原感染的藥物靶標，對有效防治家蠅及其相關(guān)的傳染性疾病、保障人民生命財產(chǎn)安全具有重要的戰(zhàn)略意義。
目前，幾個昆蟲PAP的激活機制已經(jīng)報道，其中，研究較為清楚的有三種：第一種是家蠶PAP，僅1種，它直接裂解proPO為活性的PO；第二種是煙草天蛾P(guān)AP，有3種，它們本身不能有效激活proPO，必需絲氨酸蛋白酶同系物（serpine protease homologue，SPH）的參與；第三種是東北大黑鰓金龜PAP，也有3種，其中1種作用類似SPH，另1種直接裂解proPO，但產(chǎn)生的PO無活性，只有三種PAP同時作用，將proPO二次裂解，才產(chǎn)生有活性的PO。但是，至今未見家蠅酚氧化酶原激活酶基因克隆的報道，也沒有該類基因重組表達與功能研究的報道。
發(fā)明內(nèi)容
針對目前缺少家蠅酚氧化酶原激活酶基因克隆、重組表達與功能研究的現(xiàn)狀，我們通過家蠅轉(zhuǎn)錄組測序與序列分析，首先發(fā)現(xiàn)了3個可能的家蠅酚氧化酶原激活酶基因，名為mdPAP1、mdPAP2與mdPAP3 [Dianxiang Li，Yongli Liang, Xianwei Wang, Lei Wang, Mei Qi, Yang Yu, Yuanyuan Luan. Transcriptomic analysis of Musca domestica to reveal key genes of the prophenoloxidase-activating system. G3 (Bethesda). 2015;5(9):1827-1841.(SCI)]。
本發(fā)明利用家蠅轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene序列，設(shè)計引物，克隆并獲得了家蠅mdPAP1基因全長cDNA的核苷酸序列與其編碼蛋白的氨基酸序列，明確了其保守結(jié)構(gòu)域（發(fā)夾區(qū)clip+胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶Tryp_SPc）與功能位點，如酶原裂解激活位點、底物結(jié)合位點與催化位點。
本發(fā)明還依據(jù)mdPAP1基因開發(fā)閱讀框（ORF）的核苷酸序列，設(shè)計引物，擴增出了編碼該基因保守結(jié)構(gòu)域的cDNA片段，構(gòu)建了重組表達載體。通過轉(zhuǎn)化與篩選，獲得了高表達MdPAP1重組蛋白的大腸桿菌菌株。隨后優(yōu)化表達條件與變性及復性包涵體，純化出了MdPAP1重組蛋白，建立了可溶性家蠅MdPAP1重組蛋白生產(chǎn)的方法。經(jīng)酶活性檢測，制備的MdPAP1重組蛋白具有激活家蠅血淋巴MdproPO成MdPO的活性。經(jīng)RNAi實驗證明：家蠅mdPAP1基因被干擾后，會明顯促進家蠅死亡。由此說明，家蠅mdPAP1基因及其重組表達產(chǎn)物在激活劑、氧化劑、滅蠅劑、黑化劑和免疫劑等相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)方面有應用價值。
本發(fā)明的目的是克隆家蠅酚氧化酶原激活酶1（mdPAP1）全基因cDNA序列，進行重組表達與應用研究。下面是酚氧化酶原激活酶1（mdPAP1）基因cDNA的核苷酸序列，所示信息見SEQ ID NO.1。
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