[發明專利]一種鵝細小病毒感染性克隆的拯救方法

在審

• 申請號: 201710251311.9
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106893732A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 王建業;凌玨怡;朱國強;黃鈺;王志仙;孟霞;朱禮倩
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種GPV感染性克隆質粒轉染鵝胚拯救病毒的簡便高效方法。

背景技術

我國的養鵝業居于世界首位，也是鵝肉消費大國。鵝細小病毒是1月齡內雛鵝的一種重要疫病，死亡率可高達90％，該病自上世紀50、60年代在國內流行。目前雖已研制了弱毒疫苗供種鵝或雛鵝使用，但該病并未從田間消失，仍然持續性對養鵝業造成經濟損失。

反向遺傳技術是開展病毒研究的一種有用平臺，在闡明病毒致病機制和疫苗研制中能夠發揮重要作用。同樣，構建鵝細小病毒感染性分子克隆，以此為基礎可以對GPV的特定基因展開更為有效的研究，也是GPV疫苗研制的一個有用平臺。

病毒拯救是反向遺傳操作上的重要一環，大多是將構建的質粒或RNA轉錄產物轉染細胞的途徑來實現拯救目的。轉染原代的鵝胚成纖維細胞拯救感染性GPV也有報道，對于細小病毒而言，細胞處于分裂期時才最適于病毒復制，因此轉染時細胞所處狀態對轉染拯救結果影響很大?？傮w來看，在細胞上進行轉染不僅費事，拯救效率也不高。因此，若能建立一種簡便、高效的拯救方法，將極大的方便并推動GPV相關基礎研究的深入開展。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡便高效的鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)感染性克隆質粒的拯救方法。

本發明所述的鵝細小病毒感染性克隆質粒的拯救方法，是將GPV的完整基因組克隆入載體質粒pBSKNB，獲得重組質粒，將重組質粒與轉染試劑混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種非免疫鵝胚，重組質粒在鵝胚中得到拯救；所述pBSKNB載體，是將商品化的pBluescript II(SK)質粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位點分別用NcoI和BclI位點替換而得到。

具體地：將重組質粒與轉染試劑Lipofectamine 2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)比例混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫鵝胚。鵝胚在接種后120h～192h之間死亡，胚體具有典型的GPV感染特征，表現為胚體出血、絨毛尿囊膜水腫的典型特征。拯救出的病毒具有與親本病毒相近的生物學特性。

進一步地，為了排除轉染拯救過程中親本GPV毒株污染的可能，可通過overlap PCR方法，在重組質粒的克隆基因組內部引入兩個同義堿基突變作為遺傳標記，得到的帶有遺傳標記的重組質粒再施以轉染及拯救過程。更具體地，可以是在重組質粒的VP1基因中引入兩個突變堿基作為遺傳標記。

本發明中，所述的重組質粒是插入GPV LH株完整基因組pLH質粒，或者是插入GPV LH株完整基因組并引入遺傳標記的pLHΔ質粒，但是，本發明的拯救方法適用于但不僅限于插入GPV LH株完整基因組的pLH質粒或pLHΔ質粒。對其它GPV強毒分離株或者鵝胚化弱毒株，以本發明內容公開的相同構建方法克隆其全基因組，獲得重組質粒，重組質粒的拯救方法同pLH質?；騪LHΔ質粒。

本發明所述的質粒pLH，它的構建方法在于：超速離心濃縮GPV LH株病毒，提取病毒的基因組單鏈DNA，體外退火后生成雙股DNA。選用BclI和NcoI酶切基因組DNA生成亞基因組片段，分別克隆入自行改造的pBSKNB載體的相應酶切位點，再通過酶切-連接的常規分子操作，拼接獲得含有完整基因組的質粒pLH。

進一步地，通過overlap PCR方法，在pLH質粒的VP1基因中引入兩個同義突變堿基作為遺傳標記，獲得質粒pLHΔ。

本發明中所述相近的生物學特性是指在鵝胚半數致死量(ELD₅₀)和感染試驗中的雛鵝死亡率這兩個關鍵指標上，拯救病毒具有與親本病毒相近的數值。

本發明公開了LH株的完整基因組序列。LH株基因組由5047個堿基組成(SEQ IB NO.5)，LH株的ITR由414個堿基組成，其中375個堿基形成回文結構，其余39個堿基構成D區序列?；蚪M左側的ITR的D區序列與右側ITR的D′序列反向互補，這一特性將使得基因組分子能夠形成一個更大范圍的回文。

作為一個具體的操作，本發明公開了一種GPV全基因組克隆的構建方法，該方法對其它GPV毒株同樣適用，它包括如下步驟：

(1)GPV核酸的提取

GPVLH株在鵝胚中增殖，收集的尿囊液分別經差速和超速離心濃縮到原有體積的1/50。采用SDS-蛋白酶K消化法提取病毒核酸。經95℃變性10min，緩慢冷卻至65℃退火，使單股DNA形成雙股DNA，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到約5.1kb基因組DNA。

(2)全基因組克隆的構建