[發明專利]一種鵝細小病毒感染性克隆的拯救方法

在審

• 申請號: 201710251311.9
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106893732A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 王建業;凌玨怡;朱國強;黃鈺;王志仙;孟霞;朱禮倩
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種鵝細小病毒(GPV)感染性克隆質粒的拯救方法，其特征在于，是將GPV的完整基因組克隆入載體質粒pBSKNB，獲得重組質粒；將重組質粒與轉染試劑混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種非免疫鵝胚，重組質粒在鵝胚中得到拯救；所述pBSKNB載體，是將pBluescript II(SK)質粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位點分別用NcoI和BclI位點替換而得到。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：將重組質粒與轉染試劑Lipofectamine 2000按照1:2.5(μg/μl)比例混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫鵝胚；鵝胚在接種后120h～192h之間死亡，胚體具有典型的GPV感染特征，表現為胚體出血、絨毛尿囊膜水腫的典型特征。拯救出的病毒具有與親本病毒相近的生物學特性。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質粒是pLH，它的構建方法為：超速離心濃縮GPV LH株病毒，提取病毒的基因組單鏈DNA，體外退火后生成雙股DNA；選用BclI和NcoI酶切基因組DNA生成亞基因組片段，分別克隆入pBSKNB載體的相應酶切位點，再通過酶切-連接的分子操作，拼接獲得含有完整基因組的質粒pLH。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述的重組質粒的克隆基因組內部引入兩個同義堿基突變作為遺傳標記，帶有遺傳標記的重組質粒再與轉染試劑混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫鵝胚，帶有遺傳標記的重組質粒在鵝胚中得到拯救。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述帶有遺傳標記的重組質粒是pLHΔ，它的構建方法為：超速離心濃縮GPV LH株病毒，提取病毒的基因組單鏈DNA，體外退火后生成雙股DNA；選用BclI和NcoI酶切基因組DNA生成亞基因組片段，分別克隆入pBSKNB載體的相應酶切位點，再通過酶切-連接的分子操作，拼接獲得含有完整基因組的質粒pLH；進一步通過overlap PCR方法，在pLH質粒的VP1基因中引入兩個突變堿基作為遺傳標記，獲得質粒pLHΔ。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述相近的生物學特性是指在鵝胚半數致死量(ELD₅₀)和感染試驗中的雛鵝死亡率這兩個關鍵指標上，拯救病毒具有與親本病毒相近的數值。