[發明專利]一種CAR-T細胞培養流程

在審

• 申請號: 201710251012.5
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN108728416A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 隋長江
• 申請（專利權）人: 沈陽美達博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種CAR?T細胞培養流程，涉及一種生物學技術領域。該發明由包含以下步驟：S10、操作前準備；S20、分離單個核細胞；S30、細胞培養；S40、CAR?T細胞收集；S50、細胞運輸與保存。本發明流程簡單，方便生產，存儲方便，適合廣泛生產。

技術領域

本發明涉及一種生物學技術領域，特別是涉及一種CAR-T細胞培養流程。

背景技術

隨著基因工程技術的發展和對T細胞識別認識的提高，腫瘤靶向受體——CAR應運而生，因此也有了將CAR轉染至人的T細胞從而增強過繼免疫治療的抗原識別特異性和殺傷功能的技術。CAR的設計基礎是將胞外配體識別區域——較為典型的是單鏈可變區域---scFv片段，與包括CD3ζ的胞內信號分子連接起來，再通過與抗原相互作用有效激活T細胞。基于TCR信號進行設計的CAR-T細胞，在難治性的B細胞惡性腫瘤治療中已經勘稱成功。但CAR-T細胞在治療上皮源性惡性腫瘤的的安全性和有效性上均有待提高。所以一切基礎都是如何培養CAR-T細胞。

發明內容

針對上述問題中存在的不足之處，本發明提供一種CAR-T細胞培養流程，使其流程簡單，方便生產，存儲方便，適合廣泛生產。

為了解決上述問題，本發明提供一種CAR-T細胞培養流程，其中，包括以下步驟：

S10、操作前準備

S101、凈化室、生物安全柜消毒完畢后，開啟凈化空調運行30min，生物安全柜運行穩定；從試劑間冰箱中取出細胞培養基，恢復室溫；

S102、生物安全柜表面75％酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒轉入安全柜內。

S20、分離單個核細胞

S201、使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋內外周血轉入50ml離心管中；

S202、用PBS緩沖液按1∶1稀釋外周血，混勻；

S203、將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的15ml人淋巴細胞分離液的離心管中；

S204、按照2100r/min的轉數，配平離心1200g，離心20min，慢升慢降；

S205、離心完成后，離心管出現明顯分層由下至上：紅細胞層，粒細胞層，Ficoll層，單個核細胞層和血漿層，吸取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之，小心吸取紅細胞層以上的所有液體至離心管中，PBS稀釋，與細胞懸液體積比應大于1∶3，混勻；

S206、按照1600r/min的轉數，離心600g，5min，PBS重懸細胞混勻，取少量細胞計數；

S207、按照1200r/min的轉數，離心300g，5min，上清液送檢無菌檢測。

S30、細胞培養

S301、細胞培養條件：恒溫37℃，CO2濃度5％，相對飽和濕度95％，細胞培養基PH值7.2-7.4；

S302、根據細胞計數調密度2x106/ml加入培養瓶中，混勻放入CO2培養箱培養2小時；

S303、取出培養瓶，輕搖，使沉降于底部的懸浮細胞浮起，培養瓶傾斜30度角，移液管吸取培養基轉入離心管中，少些培養基洗培養瓶將懸浮細胞全部收集，混勻計數；

S304、根據細胞計數調整細胞濃度1.2x106/ml接種培養瓶中，加CD3/CD28磁珠，按細胞與磁珠比例為1∶3，加入IL-2 100U/ml，混勻放入CO2培養箱培養；

S305、次日細胞培養1天，調整細胞密度至0.6x106/ml，加入病毒混勻放入CO2培養箱培養；