[發(fā)明專利]一種CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)流程

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710251012.5
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN108728416A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 隋長江
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽美達(dá)博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)流程，其特征在于，包括以下步驟：

S10、操作前準(zhǔn)備

S101、凈化室、生物安全柜消毒完畢后，開啟凈化空調(diào)運(yùn)行30min，生物安全柜運(yùn)行穩(wěn)定；從試劑間冰箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)基，恢復(fù)室溫；

S102、生物安全柜表面75％酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒轉(zhuǎn)入安全柜內(nèi)。

S20、分離單個核細(xì)胞

S201、使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋內(nèi)外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中；

S202、用PBS緩沖液按1∶1稀釋外周血，混勻；

S203、將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的15ml人淋巴細(xì)胞分離液的離心管中；

S204、按照2100r/min的轉(zhuǎn)數(shù)，配平離心1200g，離心20min，慢升慢降；

S205、離心完成后，離心管出現(xiàn)明顯分層由下至上：紅細(xì)胞層，粒細(xì)胞層，F(xiàn)icoll層，單個核細(xì)胞層和血漿層，吸取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之，小心吸取紅細(xì)胞層以上的所有液體至離心管中，PBS稀釋，與細(xì)胞懸液體積比應(yīng)大于1∶3，混勻；

S206、按照1600r/min的轉(zhuǎn)數(shù)，離心600g，5min，PBS重懸細(xì)胞混勻，取少量細(xì)胞計(jì)數(shù)；

S207、按照1200r/min的轉(zhuǎn)數(shù)，離心300g，5min，上清液送檢無菌檢測。

S30、細(xì)胞培養(yǎng)

S301、細(xì)胞培養(yǎng)條件：恒溫37℃，CO2濃度5％，相對飽和濕度95％，細(xì)胞培養(yǎng)基PH值7.2-7.4；

S302、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)密度2x106/ml加入培養(yǎng)瓶中，混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)；

S303、取出培養(yǎng)瓶，輕搖，使沉降于底部的懸浮細(xì)胞浮起，培養(yǎng)瓶傾斜30度角，移液管吸取培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入離心管中，少些培養(yǎng)基洗培養(yǎng)瓶將懸浮細(xì)胞全部收集，混勻計(jì)數(shù)；

S304、根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度1.2x106/ml接種培養(yǎng)瓶中，加CD3/CD28磁珠，按細(xì)胞與磁珠比例為1∶3，加入IL-2 100U/ml，混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

S305、次日細(xì)胞培養(yǎng)1天，調(diào)整細(xì)胞密度至0.6x106/ml，加入病毒混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

S306、細(xì)胞培養(yǎng)3天，細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基，IL-2100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)；

S307、細(xì)胞培養(yǎng)5天去磁珠，細(xì)胞混勻轉(zhuǎn)離心管中，在磁力架上去除磁珠，細(xì)胞計(jì)數(shù)補(bǔ)加培養(yǎng)基，IL-2100U/ml細(xì)胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)；

S308、定期觀察細(xì)胞生長情況，主要觀察其形態(tài)的變化，數(shù)目及增值情況，細(xì)胞碎片及雜質(zhì)情況，每2-3天加液培養(yǎng)；

S309、根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和臨床治療需要，培養(yǎng)9天時(shí)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到要求，各項(xiàng)檢測合格。

S40、CAR-T細(xì)胞收集

S401、根據(jù)治療方案，取出相應(yīng)細(xì)胞懸液，剩余細(xì)胞補(bǔ)加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，供再次回輸；

S402、細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，300g離心5min；

S403、除去上清培養(yǎng)液，加PBS緩沖液稀釋混勻，300g離心5min，棄上清，PBS緩沖液300g/min離心5min；

S404、細(xì)胞裝袋，離心完成后取上清，做無菌檢測，20ml生理鹽水重懸細(xì)胞，100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞活率，革蘭氏檢測，內(nèi)毒素檢測。細(xì)胞過濾完成，轉(zhuǎn)入100ml鹽水袋中，加5％注射用人血白蛋白，貼上標(biāo)簽，并填寫相關(guān)記錄。

S50、細(xì)胞運(yùn)輸與保存。

2.如權(quán)利要求1所述的一種CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)流程，其特征在于，所述S203的具體方法為：用10ml移液管吸取血樣，伸至分離液液面上方0.5cm處，血樣自然滑落鋪至分離液面上，然后輕輕加入血樣，注意不要沖破液面。

3.如權(quán)利要求1所述的一種CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)流程，其特征在于，所述S50中，細(xì)胞運(yùn)輸保存溫度保持在4度左右，運(yùn)輸人員在運(yùn)輸過程中避免距離震蕩，并在規(guī)定時(shí)間內(nèi)送到。

4.如權(quán)利要求1所述的一種CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)流程，其特征在于，所述S304中，加磁珠之前，磁珠用培養(yǎng)基洗滌3次，去除保存液。