[發明專利]一種利用CD3制備CAR-T細胞的方法

在審

• 申請號: 201710250955.6
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN108728415A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 隋長江
• 申請（專利權）人: 沈陽美達博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用CD3制備CAR-T細胞的方法，其特征在于，將包含CAR的病毒感染CD3陽性T細胞得到所述CAR-T細胞。

2.如權利要求1所述的一種利用CD3制備CAR-T細胞的方法，其特征在于，CD3陽性T細胞由包括以下步驟制備而成：

S10、T細胞的分離

S101、抽20ml血到抗凝管內，或每1ml全血加入0.1ml(125-250)/ml肝素液搖勻，匯總到50ml離心管，加入20mlPBS稀釋；

S102、提前在15ml離心管內加入3ml淋巴分離液；

S103、用刻度吸管沿傾斜管壁，把稀釋液緩慢疊加與分層液面，注意保持界面清楚，3ml全血+3mlPBS+3ml淋巴細胞分離液；離心2000r，20min；

S104、離心后取出離心管，可見管內液體有分層，抽取單個核細胞層至50ml離心管，加入5倍體積的PBS混勻；2000r，10min離心；

S105、用PBS重懸，計數T細胞；離心1500r，10min；用含血清的1640培養基重懸細胞為1×107/ml；

S20、CD3陽性T的篩選

S201、磁珠的洗滌

S2011、將小管內的免疫磁珠搖勻懸浮＞30s或傾斜旋轉5min；

S2012、取出所需量的免疫磁珠到1.5ml試管內，單個核細胞總數為1×107/ml，每毫升中適宜磁珠數量為2.5×107個；

S2013、加入1ml含血清的1640并混懸好，漩渦＞30s，或保持滾動至少5min；

S2014、將試管放入磁體架內1min，吸管吸棄上清；

S2015、試管離開磁體，用與初始免疫磁珠體積等量體積的培養液重懸磁珠；

S202、分離

S2021、將混懸好的免疫磁珠試管放在磁性細胞分離架上，吸取上清，加入單個核細胞懸液，拿起試管，離開磁場，輕輕混懸幾秒鐘；

S2022、將免疫磁珠和樣本放在4℃冰箱孵育20min，傾斜旋轉；

S2023、將試管放在細胞分離架上分離2min，待磁珠結合細胞到達試管壁后用吸管輕輕吸取上清；

S2024、試管離開磁體，加入1ml含血清的1640，輕輕混合，洗滌，盡量使磁珠脫離細胞的丟失減少到最低；

S2025、將試管放在磁體上2min，用吸管吸棄上清，重復清洗2次；

S2026、洗完后，加含血清的1640到篩選的CD3陽性細胞中，混懸，計數。

3.如權利要求2所述的，其特征在于，制備得到的CD3陽性T細胞還包括進一步培養的步驟，所述培養采用的培養基為Lonza x-vivo 15培養基。

4.如權利要求3所述的，其特征在于，所述的Lonza x-vivo 15培養基可通過市售購買。