[發(fā)明專利]一種利用CD3制備CAR-T細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710250955.6
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN108728415A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 隋長江
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽美達(dá)博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種利用CD3制備CAR?T細(xì)胞的方法，涉及一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該發(fā)明是將包含CAR的病毒感染CD3陽性T細(xì)胞得到CAR?T細(xì)胞。本發(fā)明制備出的CAR?T細(xì)胞有效性好，安全性高，方法簡單易行，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用CD3制備CAR-T細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和對T細(xì)胞識別認(rèn)識的提高，腫瘤靶向受體——CAR應(yīng)運(yùn)而生，因此也有了將CAR轉(zhuǎn)染至人的T細(xì)胞從而增強(qiáng)過繼免疫治療的抗原識別特異性和殺傷功能的技術(shù)。CAR的設(shè)計基礎(chǔ)是將胞外配體識別區(qū)域——較為典型的是單鏈可變區(qū)域---scFv片段，與包括CD3ζ的胞內(nèi)信號分子連接起來，再通過與抗原相互作用有效激活T細(xì)胞。基于TCR信號進(jìn)行設(shè)計的CAR-T細(xì)胞，在難治性的B細(xì)胞惡性腫瘤治療中已經(jīng)勘稱成功。但CAR-T細(xì)胞在治療上皮源性惡性腫瘤的的安全性和有效性上均有待提高。所以一切基礎(chǔ)都是如何培養(yǎng)CAR-T細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種利用CD3制備CAR-T細(xì)胞的方法，使其制備出的CAR-T細(xì)胞有效性好，安全性高，方法簡單易行，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種利用CD3制備CAR-T細(xì)胞的方法，將包含CAR的病毒感染CD3陽性T細(xì)胞得到所述CAR-T細(xì)胞。

優(yōu)選的，CD3陽性T細(xì)胞由包括以下步驟制備而成：

S10、T細(xì)胞的分離

S101、抽20ml血到抗凝管內(nèi)，或每1ml全血加入0.1ml(125-250)/ml肝素液搖勻，匯總到50ml離心管，加入20mlPBS稀釋；

S102、提前在15ml離心管內(nèi)加入3ml淋巴分離液；

S103、用刻度吸管沿傾斜管壁，把稀釋液緩慢疊加與分層液面，注意保持界面清楚，3ml全血+3mlPBS+3ml淋巴細(xì)胞分離液；離心2000r，20min；

S104、離心后取出離心管，可見管內(nèi)液體有分層，抽取單個核細(xì)胞層至50ml離心管，加入5倍體積的PBS混勻；2000r，10min離心；

S105、用PBS重懸，計數(shù)T細(xì)胞；離心1500r，10min；用含血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞為1×107/ml；

S20、CD3陽性T的篩選

S201、磁珠的洗滌

S2011、將小管內(nèi)的免疫磁珠搖勻懸浮＞30s或傾斜旋轉(zhuǎn)5min；

S2012、取出所需量的免疫磁珠到1.5ml試管內(nèi)，單個核細(xì)胞總數(shù)為1×107/ml，每毫升中適宜磁珠數(shù)量為2.5×107個；

S2013、加入1ml含血清的1640并混懸好，漩渦＞30s，或保持滾動至少5min；

S2014、將試管放入磁體架內(nèi)1min，吸管吸棄上清；

S2015、試管離開磁體，用與初始免疫磁珠體積等量體積的培養(yǎng)液重懸磁珠；

S202、分離

S2021、將混懸好的免疫磁珠試管放在磁性細(xì)胞分離架上，吸取上清，加入單個核細(xì)胞懸液，拿起試管，離開磁場，輕輕混懸?guī)酌腌姡?/p>

S2022、將免疫磁珠和樣本放在4℃冰箱孵育20min，傾斜旋轉(zhuǎn)；

S2023、將試管放在細(xì)胞分離架上分離2min，待磁珠結(jié)合細(xì)胞到達(dá)試管壁后用吸管輕輕吸取上清；

S2024、試管離開磁體，加入1ml含血清的1640，輕輕混合，洗滌，盡量使磁珠脫離細(xì)胞的丟失減少到最低；