[發明專利]一種用于TNF?α檢測的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法

在審

• 申請號: 201710250435.5
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106970076A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 孔宇;孔令洪;楊桂芳;樊璠;祁紅斌;劉健康;龍建綱
• 申請（專利權）人: 西安交通大學;蘇州頤生方生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 西安智大知識產權代理事務所61215
• 代理人: 劉國智

技術領域

本發明屬于檢測試劑技術領域，涉及一種用于TNF-α檢測的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法。

背景技術

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s Disease，AD)是一種危害性高、醫療護理成本巨大、尚無根治方法的神經退行性疾病，隨著我國社會老齡化過程，患者人數逐年增加。而AD早期診斷一直是國際性的難題。

目前，已有的臨床檢測AD手段主要為：依靠認知能力測試結合核磁共振掃描判斷AD病理發展，鑒定結果可靠度高，但對AD的早期診治敏感性不佳(患者沒有明顯癥狀或具有輕微的認知功能的減退)，此外，檢測樣本為腦脊液，取樣時常采用脊椎穿刺等手段，時常伴有副作用，而且不能以一定的時間間隔進行多次取樣，給疾病的追蹤性檢測與治療效果的監測帶來困難；在臨床AD標志物，特別是AD早期標志物方面，尚無公認的簡便、可靠的臨床檢測指標或標準，亟待攻關解決。

體液標志物作為一種敏感性佳、特異性高、易于使用的指示劑，可真實反應AD的病理進程。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產生的炎癥因子，參與機體的炎癥反應。腦內慢性炎癥反應是AD的重要病理特征之一。

發明內容

本發明解決的問題在于提供一種用于TNF-α檢測的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法，該試紙條利用核酸適配體和納米金交聯復合物進行檢測，其檢測簡便、靈敏、快速，可用于老年癡呆的早期篩查。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種用于TNF-α檢測的半定量核酸適配體試紙條，包括兩端分別設有樣品墊和吸水墊的底板，底板的中部設置有硝酸纖維素膜檢測層；硝酸纖維素膜檢測層上靠近吸水墊的一端設有檢測線，檢測線包被有特異性結合生物素的鏈霉親和素；在硝酸纖維素膜檢測層和樣品墊之間設置有結合墊，結合墊上摻有適配體納米金復合物；樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接；

所述的適配體納米金復合物是不能通過硝酸纖維素膜檢測層的核酸-適配體-納米金網格狀復合物，其中核酸連接在納米金顆粒上并雜交形成雙鏈，適配體能夠與TNF-α特異性識別，在識別后打開雙鏈，使核酸-適配體-納米金網格狀復合物分解；納米金顆粒上還連接有末端設有生物素的單鏈核酸，其在適配體納米金復合物分解后能通過硝酸纖維素膜檢測層，并泳動到檢測線處。

所述的適配體納米金復合物，是AuNPs-DNA1顆粒和AuNPs-DNA2，3顆粒通過DNA1、DNA2與Linker通過DNA雜交后形成的核酸-適配體-納米金網格狀復合物；

所述的AuNPs-DNA1顆粒是巰基化的DNA1連接于納米金顆粒上，AuNPs-DNA2，3顆粒是巰基化的DNA2、DNA3分別連接于納米金顆粒上；

所述的Linker含有與TNF-α特異性結合的適配體序列，且Linker的兩端分別與DNA1、DNA2相互補；DNA1、DNA2和Linker可雜交形成雙鏈；DNA3的末端設有生物素，其序列不能與DNA1、DNA2相雜交。

所述的DNA1的核苷酸序列為：TCACTTCGCTGAAAAAAA-(CH₃)₃-SH；

所述的DNA2的核苷酸序列為：SH-(CH₃)₆-CTGTATTGTCGC；

所述的Linker的核苷酸序列為：TCCTCCATCCGCGAGTGGGCGACAATACTGTCAGCGTTCACT；其中適配體序列為TGGTCCTAGGCGCAGAGCGCATGTA。

當樣品墊存在TNF-α時，TNF-α特異性結合適配體納米金復合物，使連接構成適配體納米金復合物的Linker從其上分離，分離后的帶有生物素的顆粒通過硝酸纖維素膜，與檢測線上的鏈霉親和素結合，從而顯示出紅色，TNF-α濃度越大，則紅色越明顯。

所述的樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊在相搭接時相互重疊1～3mm。

所述的用于TNF-α檢測的半定量核酸適配體試紙條的制備方法，包括以下操作：

1)利用檸檬酸鈉還原法制備出粒徑13～20nm的納米金顆粒；

2)巰基化的DNA1與納米金經鹽老化方法連接形成AuNPs-DNA1顆粒；

巰基化的DNA2、DNA3與納米金經鹽老化方法連接形成AuNPs-DNA2，3顆粒；