[發(fā)明專利]一種用于TNF?α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710250435.5
• 申請(qǐng)日: 2017-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN106970076A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔宇;孔令洪;楊桂芳;樊璠;祁紅斌;劉健康;龍建綱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安交通大學(xué);蘇州頤生方生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78
• 代理公司: 西安智大知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所61215
• 代理人: 劉國(guó)智

1.一種用于TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，其特征在于，包括兩端分別設(shè)有樣品墊(2)和吸水墊(5)的底板(1)，底板(1)的中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層(4)；硝酸纖維素膜檢測(cè)層(4)上靠近吸水墊(5)的一端設(shè)有檢測(cè)線(6)，檢測(cè)線(6)包被有特異性結(jié)合生物素的鏈霉親和素；在硝酸纖維素膜檢測(cè)層(4)和樣品墊(2)之間設(shè)置有結(jié)合墊(3)，結(jié)合墊(3)上摻有適配體納米金復(fù)合物；樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)和吸水墊(5)依次搭接；

所述的適配體納米金復(fù)合物是不能通過(guò)硝酸纖維素膜檢測(cè)層的核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物，其中核酸連接在納米金顆粒上并雜交形成雙鏈，適配體能夠與TNF-α特異性識(shí)別，在識(shí)別后打開雙鏈，使核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物分解；納米金顆粒上還連接有末端設(shè)有生物素的單鏈核酸，其在適配體納米金復(fù)合物分解后能通過(guò)硝酸纖維素膜檢測(cè)層，并泳動(dòng)到檢測(cè)線處。

2.如權(quán)利要求1所述的用于TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，其特征在于，所述的適配體納米金復(fù)合物，是AuNPs-DNA1顆粒和AuNPs-DNA2，3顆粒通過(guò)DNA1、DNA2與Linker通過(guò)DNA雜交后形成的核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物；

所述的AuNPs-DNA1顆粒是巰基化的DNA1連接于納米金顆粒上，AuNPs-DNA2，3顆粒是巰基化的DNA2、DNA3分別連接于納米金顆粒上；

所述的Linker含有與TNF-α特異性結(jié)合的適配體序列，且Linker的兩端分別與DNA1、DNA2相互補(bǔ)；DNA1、DNA2和Linker可雜交形成雙鏈；DNA3的末端設(shè)有生物素，其序列不能與DNA1、DNA2相雜交。

3.如權(quán)利要求2所述的用于TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，其特征在于，所述的DNA1的核苷酸序列為：TCACTTCGCTGAAAAAAA-(CH₃)₃-SH；

所述的DNA2的核苷酸序列為：SH-(CH₃)₆-CTGTATTGTCGC；

所述的Linker的核苷酸序列為：TCCTCCATCCGCGAGTGGGCGACAATACTGTCAGCGTTCACT；其中適配體序列為TGGTCCTAGGCGCAGAGCGCATGTA。

4.如權(quán)利要求1或2所述的用于TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，其特征在于，當(dāng)樣品墊(2)存在TNF-α?xí)r，TNF-a特異性結(jié)合適配體納米金復(fù)合物，使連接構(gòu)成適配體納米金復(fù)合物的Linker從其上分離，分離后的帶有生物素的顆粒通過(guò)硝酸纖維素膜，與檢測(cè)線上的鏈霉親和素結(jié)合，從而顯示出紅色，TNF-α濃度越大，則紅色越明顯。

5.如權(quán)利要求1所述的用于TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，其特征在于，所述的樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(5)在相搭接時(shí)相互重疊1～3mm。

6.權(quán)利要求1所述的用于TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下操作：

1)利用檸檬酸鈉還原法制備出粒徑13～20nm的納米金顆粒；

2)巰基化的DNA1與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成AuNPs-DNA1顆粒；

巰基化的DNA2、DNA3與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成AuNPs-DNA2，3顆粒；

3)將AuNPs-DNA1顆粒、AuNPs-DNA2，3顆粒和Linker在緩沖溶液中雜交形成藍(lán)色的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物；將得到的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物離心，去除上清，沉淀重懸；

所述的Linker含有與TNF-α特異性結(jié)合的適配體序列，且Linker的兩端分別與DNA1、DNA2相互補(bǔ)；DNA1、DNA2和Linker可雜交形成雙鏈；DNA3的末端設(shè)有生物素，其序列不能與DNA1、DNA2相雜交；

4)將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼組裝到底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分為1～3毫米；

5)將核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物重懸液加于結(jié)合墊上，烘干；

6)在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線位置加鏈霉親和素溶液，烘干后完成TNF-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備。