[發明專利]一種檢測食管鱗狀細胞癌循環腫瘤細胞的微流體系統及其應用

在審

• 申請號: 201710250399.2
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN107085107A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 林泉;俞玨華;程禹
• 申請（專利權）人: 無錫準因生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/531
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙)11411
• 代理人: 黃冠華

技術領域

本發明涉及用于循環腫瘤細胞檢測的微流體系統，具體為一種檢測食管鱗狀細胞癌循環腫瘤細胞的基于硅納米線基底的微流體系統。

背景技術

隨著污染程度的增加，腫瘤的患病幾率已經高于1/3的比例。對于腫瘤的診斷方法主要包括：病理學(活檢切片)；影像學(超聲、X光、CT或PET等)和血清學(血清腫瘤相關蛋白，如CA-125、CA-199或CEA等)。然而這些方法對存在自身的缺陷，不能為不斷變化腫瘤和診斷預警提供幫助。目前臨床公認的人外周血循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell，簡稱CTC)檢測目前已被公認為最好檢測手段之一。

在2004年，美國藥品與食品監督管理局首次批準通過了第一個有關CTC富集和計數的技術產品。這一產品是利用細胞表面所表達的上皮細胞粘附分子(EpCAM)與干細胞因子受體(cKit)來完成細胞的分選的。EpCAM在絕大多數的上皮細胞上多有表達，因此在來源于上皮細胞的腫瘤細胞中也有表達。c-Kit是典型的Ⅲ型受體酪氨酸激酶,在腫瘤的發生發展以及侵襲、遷移和復發過程中起著十分重要的作用,是目前腫瘤分子靶向治療的熱門靶標之一。修飾有anti-EpCAM或anti-cKit的磁珠與固化的血液細胞相互作用，這樣一來所有表達EpCAM或cKit的細胞表面都會附著一些磁珠，最后再通過磁場進行分選。要進一步識別雙陽性CTC,所有被捕獲的細胞會首先從磁珠上解離下來，然后用細胞角蛋白Krt19以及白細胞抗原(CD45)的熒光抗體進行標記。在這一系統中，對于CTC的技術定義是EpCAM+/cKit+/CD45-有細胞核的物體。該設備和方法已被作為一個嵌入式生物標志物應用在幾個治療相關的臨床試驗中。首個有關CTC計數檢測的大規模臨床試驗是于2004年進行的，主要針對已經發生轉移的乳腺癌病人。這次試驗所得出的治療前和治療期間的CTC檢測結果同時預測了無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)。很短的時間內，在多種不同的癌癥研究中也進行了類似的CTC計數測試，其中就包括腸癌、皮膚癌、肺癌和前列腺癌，并且得出了類似的發現。值得注意的是，這些研究大多將CTC計數檢測結果分為兩類：定性的作為(對于評價病人病情)有利或者不利，而不是把他們作為一個可連續變化的定量數據。

目前CTC技術的局限性所帶來的各種問題。首先，在CTC研究中檢測靈敏度還是至關重要的影響因素。FDA批準通過的CTC技術在50％的食管鱗狀細胞癌病人中都無法檢測出CTC。其次，基于EpCAM單獨抗體的CTC富集技術會無法檢測出正在發生上皮間質化轉化的腫瘤細胞。早期的CTC研究已經證明有些病人的CTC具有間質化特征，所以通常認為上皮間質化現象在CTC的產生過程中起著非常重要的作用。第三，僅僅對CTC進行計數，忽視了CTC中亞群的重要意義。在最近的研究中顯示，一些CTC所具有的特異形貌特征和剪接變異體的表達與腫瘤內臟轉移和癌癥抗藥性有關聯。這些發現都指出CTC作為腫瘤標志物，不僅僅用來做計數。第四，將血液樣品先固定化再進行檢測的方法會限制分離CTC后下游的分子分析研究。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現CTC檢測時純度和靈敏度不夠高，同時捕獲的CTC不能繼續用于后序研究的缺陷，提供一種檢測食管鱗狀細胞癌循環腫瘤細胞的基于硅納米線基底的微流體系統。

為了解決上述技術問題，本發明提供了如下的技術方案：

一種檢測食管鱗狀細胞癌循環腫瘤細胞的微流體系統，采用以下步驟制備：

一、PDMS微流體芯片的制作

PDMS微流體管道系統包括一個入口和一個出口，從入口處分為2條以上平行的微流體信道，微流體信道內設置有若干個魚骨結構；優選的魚骨結構為由PDMS打印成的若干個V形槽，單個魚骨結構內V形槽相互平行，相鄰的魚骨結構的V形槽的頂角上下交錯；在入口和出口處均設置有PDMS孔洞；

優選的所述PDMS微流體管道系統從入口處分為2條平行的微流體信道，各信道長為25mm，寬位2mm；所述微流體信道內魚骨結構的寬為50微米，間距50微米，高30微米。這種魚骨結構增加了細胞捕捉效率，而且可以在流道內產生明顯的渦流，可以批量低成本生產。

優選的，所述PDMS微流體管道的各分流處設置有圓角，一方面增加樣本導流，另一方面減低細胞因剪切力造成的傷害。在進入信道0.5mm處才開始產生由魚骨結構產生的渦流效應，魚骨結構對細胞溶液攪動，增加細胞接觸硅納米線的機會；