[發(fā)明專利]一種檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710250399.2
• 申請(qǐng)日: 2017-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN107085107A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林泉;俞玨華;程禹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫準(zhǔn)因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/574
• 分類號(hào): G01N33/574;G01N33/531
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11411
• 代理人: 黃冠華

1.一種檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng),其特征在于，采用以下步驟制備：

一、PDMS微流體芯片的制作

PDMS微流體管道系統(tǒng)包括一個(gè)入口和一個(gè)出口，從入口處分為2條以上平行的微流體信道，微流體信道內(nèi)設(shè)置有若干個(gè)魚骨結(jié)構(gòu)，在入口和出口處均設(shè)置有PDMS孔洞；

二、硅納米線基底的刻蝕

1)、在硅片上旋轉(zhuǎn)涂覆SU-8光阻膠，通過標(biāo)準(zhǔn)光刻方法限定刻蝕區(qū)域，僅刻蝕平行的微流體信道需要覆蓋的區(qū)域；

2)、通過NH4F/AgNO3試劑引入Ag納米顆粒沉積，在硅片表面形成鈉米粒子膜；

3)、采用H₂O₂/NH4F進(jìn)行刻蝕，得到與平行的微流體信道相對(duì)應(yīng)的鈉米線；

4)、先采用濃硝酸洗去Ag納米顆粒，然后采用濃硫酸/雙氧水混合溶液清洗硅片表面，然后去離子水洗滌干凈；濃硫酸/雙氧水的體積比為3:1；

三、硅納米線的表面修飾和生物功能化

1)、用無水乙醇清洗硅納米線基底，超凈環(huán)境下N2氣吹干；

2)、新鮮制備的質(zhì)量濃度為1.0％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并將清洗干燥后的具有硅納米線的硅片浸泡在其中半小時(shí)；

3)、取出表面鍵合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅片，用工業(yè)級(jí)乙醇清洗，N2氣吹干；

4)、將硅片在新鮮制備的50ng/mL的聚乙二醇2-氨基乙基醚生物素PBS溶液中靜置3小時(shí)，以工業(yè)級(jí)乙醇清洗，N2氣吹干后保存在4℃干燥環(huán)境下備用；

5)、在樣品測(cè)試前，用PBS清洗芯片表面兩次后，加入200μL的5.0μM鏈霉親和素溶液，37℃孵育1小時(shí)；PBS清洗后，再和含有生物素修飾的p-EpCAM和p-cKit兩種多肽的200μL PBS溶液共孵育1小時(shí)，以PBS清洗后用于CTC的捕獲；

四、硅納米線基底的修飾和PDMS微流體芯片的組裝

1)、制備5.0μM的鏈霉親和素PBS溶液200μL，覆蓋在PDMS微流體芯片上，于37℃靜置1小時(shí)，PBS清洗三遍；PBS清洗后，再和含有生物素修飾的p-EpCAM和p-cKit兩種多肽的200μL PBS溶液共孵育1小時(shí)，以PBS清洗后用于CTC的捕獲；

2)、再將硅納米線基底的芯片放置到芯片載臺(tái)上，并將平行的微流體信道與鈉米線相對(duì)應(yīng)，再以載臺(tái)的上蓋壓住微流體芯片；

3)、將入口和出口處的PDMS孔洞連接分別連接Tygon流體輸送管，并和已經(jīng)安裝在注射泵上的注射器鏈接。

2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng),其特征在于，所述的魚骨結(jié)構(gòu)為由PDMS打印成的若干個(gè)V形槽，單個(gè)魚骨結(jié)構(gòu)內(nèi)V形槽相互平行，相鄰的魚骨結(jié)構(gòu)的V形槽的頂角上下交錯(cuò)。

3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng),其特征在于，硅納米線基底的刻蝕時(shí)選用厚度為0.7毫米、長為50毫米和寬為25毫米的硅片，鈉米線長度為2～5微米。

4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng),其特征在于，硅納米線基底的刻蝕時(shí)步驟2)中Ag納米顆粒沉積小于等于50nm。

5.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng),其特征在于，所述PDMS微流體管道系統(tǒng)從入口處分為2條平行的微流體信道，各信道長為25mm，寬位2mm；所述微流體信道內(nèi)魚骨結(jié)構(gòu)的寬為50微米，間距50微米，高30微米。

6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng),其特征在于，所述PDMS微流體管道的各分流處設(shè)置有圓角。

7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)、將待測(cè)樣本細(xì)胞與含有生物素修飾的p-EpCAM和p-cKit兩種多肽的200μL PBS溶液共孵育1小時(shí)，之后以1000rpm的離心方式分離出有生物素修飾p-EpCAM和p-cKit兩種多肽特異性吸附的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；

2)、將細(xì)胞待測(cè)樣本通過注射器注射進(jìn)入微流體系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。