[發明專利]一種基因合成方法

在審

• 申請號: 201710250310.2
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN107190001A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 沈鶴霄;華權高;楊明波
• 申請（專利權）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司11570
• 代理人: 王俊杰

技術領域

本發明涉及基因合成領域，具體涉及一種基因合成方法。

背景技術

目前基因合成技術普遍利用DNA聚合酶，在體外模擬DNA復制，彼此帶有 同源序列的引物在DNA聚合酶的作用下能彼此延伸得到目的DNA片段，最終將 得到的DNA片段分離純化后克隆到指定載體中測序驗證，這一技術我們稱之為 基于PCR的基因合成技術。該技術原理簡單、易用，但操作過程十分復雜，整個 過程需要經歷PCR體系的配制、上機擴增、電泳檢測回收、酶切連接、轉化等繁 瑣的實驗操作步驟；同時PCR過程會將引物本身帶有的突變放大導致合成出錯； 并且高度重復序列、高GC、高AT、反向重復、回文等高級結構因PCR不能正常 擴增而導致合成的失敗，成為基于PCR的基因合成技術的一大難點和瓶頸。與之 對應的是大量的人力，物力和時間的耗費，因此極大了限制了合成的通量和人均 產能。隨著基因研究的不斷深入，目前“讀基因”(基因測序)擁有全自動的高通 量測序儀，但“寫基因”(基因合成)全都依賴人工合成，因此繁瑣的實驗步驟、 目前技術手段的內在短板成為了寫基因的限速步驟。

發明內容

針對現有技術中的上述缺陷，本發明的主要目的在于提供一種基因合成方 法，不依賴PCR擴增，規避了PCR擴增中繁瑣的實驗步驟；同時規避了PCR技 術錯誤率高，難以擴增高度重復、高GC、高AT含量、發卡結構等難度序列的缺 陷；本發明能將具有相同或不同來源的基因同步組合合成，構建基因突變庫，具 有靈活性。

為了解決上述缺陷，本發明采用如下技術方案：一種基因合成方法，所述方 法包括：

(1)將待合成基因序列分成55-100bp長度的第一連續片段，將所述第一連 續片段設計成正向引物；將與所述第一連續片段錯開15-20bp長度處的基因序列 作為第二連續片段，在所述第二連續片段的反向互補序列上設計連續的反向引 物；

(2)將所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)將所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多個缺刻的雙鏈DNA片段；

(4)將合成的雙鏈DNA片段連接到pUC57-GFP-Amp載體上，所述載體的 序列如序列表1所示，轉化大腸桿菌細胞，反向篩選不發熒光的菌落，測序驗證。

作為進一步的優選，所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接 頭序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接頭序列。

作為進一步的優選，所述接頭序列包括載體序列的粘性末端序列和含金門克 隆反應的接頭序列。

作為進一步的優選，所述正向引物和反向引物完全覆蓋基因的正向序列和反 向互補序列，并在所述引物混合物煮沸退火時在上一引物和下一引物之間配對形 成約15-20bp長度的雙鏈。

作為進一步的優選，所述步驟(1)中，根據待合成基因的長度大小，進行 基因分組，每組長度為700-800bp，再將700-800bp長度的基因序列分成長度 55-100bp連續片段。

作為進一步的優選，所述步驟(3)中，將所述引物混合物經T4多聚核苷酸 激酶磷酸化處理后煮沸、退火，再由T4 DNA連接酶處理，將引物連成兩端帶長 粘性末端的雙鏈DNA片段。

作為進一步的優選，所述待合成基因序列的長度為500-800bp。

作為進一步的優選，所述步驟(4)中，所述pUC57-GFP-Amp載體的制備方 法包括：提供一pUC57載體，將所述pUC57載體改造獲得含GFP基因、無SapI 酶切位點的pUC57-SapI free-Amp載體，通過雙酶切和T4 DNA外切酶活性得到線 性化的兩端為長粘性末端的載體。

作為進一步的優選，所述步驟(4)中，將合成的雙鏈DNA基因連接到所述 pUC57-GFP-Amp載體上，包括：通過同源重組的方法將含粘性末端的基因連接到 含有對應長粘性末端的載體上，通過GFP熒光進行反向篩選轉化該質粒的大腸桿 菌。

作為進一步的優選，還包括：將克隆到所述載體的基因片段質粒通過1到3 輪金門克隆反應進行拼接，得到全長基因。