[發明專利]一種基因合成方法

在審

• 申請號: 201710250310.2
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN107190001A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 沈鶴霄;華權高;楊明波
• 申請（專利權）人: 武漢金開瑞生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司11570
• 代理人: 王俊杰

1.一種基因合成方法，其特征在于：所述方法包括：

(1)將待合成基因序列分成55-100bp長度的第一連續片段，將所述第一連續片段設計成正向引物；將與所述第一連續片段錯開15-20bp長度處的基因序列作為第二連續片段，在所述第二連續片段的反向互補序列上設計連續的反向引物；

(2)將所述正向引物和反向引物混合，得到引物混合物；

(3)將所述引物混合物煮沸，退火，得到含有多個缺刻的雙鏈DNA片段；

(4)將合成的雙鏈DNA片段連接到pUC57-GFP-Amp載體上，所述載體的序列如序列表1所示，轉化大腸桿菌細胞，反向篩選不發熒光的菌落，測序驗證。

2.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述正向引物中，最靠近基因5’端的引物在5’端含有接頭序列；所述反向引物中，最靠近基因3’端的引物在3’端含有接頭序列。

3.根據權利要求2所述的基因合成方法，其特征在于：所述接頭序列包括載體序列的粘性末端序列和含金門克隆反應的接頭序列。

4.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述正向引物和反向引物覆蓋基因的正向序列和反向互補序列，在所述引物混合物煮沸退火時，上一引物和下一引物之間配對形成15-20bp長度的雙鏈。

5.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步驟(1)中，根據待合成基因的長度大小，進行基因分組，每組長度為700-800bp，再將700-800bp長度的基因序列分成長度55-100bp連續片段。

6.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步驟(3)中，將所述引物混合物經T4多聚核苷酸激酶磷酸化處理后煮沸、退火，再由T4DNA連接酶處理，將引物連成兩端帶長粘性末端的雙鏈DNA片段。

7.根據權利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：所述步驟(1)中，所述待合成基因序列的長度為500-800bp。

8.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步驟(4)中，所述pUC57-GFP-Amp載體的制備方法包括：提供一pUC57載體，將所述pUC57載體改造獲得含GFP基因、無SapI酶切位點的pUC57-SapI free-Amp載體，通過雙酶切和T4DNA外切酶活性得到線性化的兩端為長粘性末端的載體。

9.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述步驟(4)中，將合成的雙鏈DNA基因連接到所述pUC57-GFP-Amp載體上，包括：通過同源重組的方法將含粘性末端的基因連接到含有對應長粘性末端的載體上，通過GFP熒光進行反向篩選轉化該質粒的大腸桿菌。

10.根據權利要求1所述的基因合成方法，其特征在于：所述方法還包括：將克隆到所述載體的基因片段質粒通過1到3輪金門克隆反應進行拼接，得到全長基因。