[發明專利]一種高通量的單細胞全基因組擴增方法

在審

• 申請號: 201710250076.3
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN107400705A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 王磊;李貴波
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司44281
• 代理人: 孫銀行,彭家恩

技術領域

本發明涉及單細胞全基因組擴增技術領域，尤其涉及一種高通量的單細胞全基因組擴增方法。

背景技術

研究表明，在胚胎發育、疾病發生與腫瘤發展等過程中，由于單個細胞的遺傳物質個體化差異與異質性，導致極其重要甚至是決定性的后果，因此對單細胞的基因組進行測序研究是必要的。目前，單細胞的基因組測序已經成功地應用于各種微生物及哺乳動物細胞。

在單細胞研究工作中，擴大試驗規模是確保采集足夠多的生物多樣性信息的關鍵。使用微流控芯片雖然可以將單個細胞分離，并進行樣品擴增，但是通量不高。其它針對單細胞的方法均存在很多缺陷，導致檢測靈敏度不高、基因表達信息丟失嚴重、技術噪音高、操作失誤率高、重復性差，而且針對數以千計甚至萬計的細胞數量時，實驗費用又成為了最大的瓶頸，高昂的單細胞擴增的費用導致單細胞擴增仍然處于不成熟的階段，在技術上和成本上還遠沒有達到大規模應用的地步。

目前，對單個細胞基因組DNA進行擴增應用最普遍、最簡單的方法是多重置換擴增(multiple displacement amplification，MDA)技術，它利用隨機引物和等溫擴增可以獲得大量高保真的DNA片段，但是該方法存在擴增偏倚及非特異擴增等問題。另外，其它發展的方法例如簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(the degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction，DOP-PCR)由于其基因覆蓋率比較低，不能檢測單個核苷酸的變異。基于多重退火和循環的擴增循環(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)方法雖然能夠抑制擴增偏倚，但是保真性較差，操作步驟相對復雜，不利于進行高通量的全基因組擴增(WGA)。

目前，商業化的單細胞WGA試劑盒不僅價格昂貴，試劑成分保密，而且反應體積都在幾十微升(μL)左右，擴增產物存在偏倚。

發明內容

本發明提供一種高通量的單細胞全基因組擴增方法，具有高通量、低成本、單細胞、一體化的特點，能夠實現單細胞全基因組擴增的自動化和規模化。

本發明的高通量的單細胞全基因組擴增方法，包括：采用納升級的微量分液平臺將具有預定細胞密度的細胞懸液分配到納升級的微孔芯片的每個微孔中；采用上述微量分液平臺將細胞裂解液分配到上述微孔中以裂解上述微孔內的細胞；采用上述微量分液平臺將中和液分配到上述微孔中以進行中和反應；采用上述微量分液平臺將全基因組擴增試劑分配到上述微孔中以進行全基因組擴增反應。

進一步地，上述全基因組擴增反應的同時采用熒光定量PCR儀輔助監測單細胞擴增情況。

進一步地，上述預定細胞密度是指2-4個細胞/微升。

進一步地，分配到上述微孔中的細胞懸液、細胞裂解液、中和液和全基因組擴增試劑的體積分別是35-50納升、35-50納升、35-50納升和100-150納升；優選地，分配到上述微孔中的細胞懸液、細胞裂解液、中和液和全基因組擴增試劑的體積分別是35納升、35納升、35納升和100納升。

進一步地，上述微孔芯片的每個微孔的容積為不小于250納升。

進一步地，將上述細胞懸液、細胞裂解液、中和液和全基因組擴增試劑分配到上述微孔中后，通過離心去除氣泡。

進一步地，上述熒光定量PCR儀輔助監測單細胞擴增情況中，以溶解曲線為單峰，同時Ct值介于陽性對照與陰性對照的數值之間，作為單細胞擴增產物的標志；其中上述陽性對照是總DNA，上述陰性對照是不含細胞的等滲溶液。

進一步地，上述方法還包括：去除最低和最高10％Ct值的樣品。

進一步地，上述細胞裂解液包含200mM的KOH，100mM的DTT和5mM的EDTA；上述中和液包含333mM的Tris-HCl和125mM的HCl。

進一步地，上述方法還包括：吸取符合單細胞擴增產物的標志的樣品，使用看家基因的引物進行PCR擴增檢測，選擇PCR擴增結果顯示多條帶的樣品進行建庫上機測序。

本發明的方法，以納升級的微量分液平臺為基礎實現單細胞的分配，進而實現一系列的原位細胞裂解、中和反應和全基因組擴增反應等，而完成單細胞全基因組擴增，具有高通量、低成本、單細胞、一體化的特點，能夠實現單細胞全基因組擴增的自動化和規模化。

附圖說明